消痰散结方对人胃癌mkn45裸鼠移植瘤生长及细

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1、消痰散结方对人胃癌MKN45裸鼠移植瘤生长及细【关键词】胃肿瘤;中药;增殖细胞核抗原;表皮生长因子受体;裸小鼠　　中医学认为恶性肿瘤的发生、发展、转移与痰邪为病有密切关系。魏品康教授根据多年临床经验研制出消痰散结复方治疗胃癌，取得较好疗效［1，2］。本研究建立裸鼠胃腺癌模型，观察该药对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用及其对胃癌组织中增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PA）和表皮生长因子受体（epidermalgrol，0.25g，由上海旭东海普药业有限公司出品（批号0604

2、04），购自长征医院药房。主要试剂鼠抗人PA单抗（稀释度1∶100，代号M0879）和EGFR单抗（稀释度1∶20，代号M0886）购自美国DAKO公司。抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶（streptavidinperoxidase,SP）连接法试剂盒和显色试剂盒，购自福建迈新公司。　　1.1.2实验动物BABL/c裸鼠，雄性，共45只，体质量（20～22）g，8～10周龄，由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。医学实验动物合格证书，编号0742；裸鼠动物合格证书，医动字第02492号。　　1.2实验方法　　1.2.

3、1裸鼠MKN45胃腺癌模型建立裸鼠MKN45人胃腺癌细胞株由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。制备接种细胞悬液，无菌操作。体外培养MKN45细胞生长密集时，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediamietraaceticacid,EDTA）消化1～2min，倾出消化液，加入无血清1640液洗涤，离心，用无血清1640液配成接种细胞，浓度为2×106/L。用相差显微镜观察呈均匀的单细胞悬液。皮下接种：无菌操作，消毒皮肤，取lml注射器，抽吸出0.4ml细胞悬液，接种在裸鼠右前肢根部皮下

4、。裸小鼠皮下移植传代，取传代后14d左右的裸小鼠，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状瘤组织，切成1mm×1mm×1mm小块，置于生理盐水中备用。裸鼠称质量后以75mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，沿上腹正中线切开约1cm，将备好的肿瘤组织块植入。术后逐日观察肿瘤生长情况，以小鼠腹部出现可触及的包块作为成瘤标志，观察小鼠一般活动及营养状态等变化。　　1.2.2实验动物分组及用药将接种后的BABL/c裸鼠随机分为3组，消痰散结方组、化疗组及荷瘤对照组，每组各15只，无特定病原

5、菌（specificpathogenfree,SPF）条件下分笼饲养于层流架内。消痰散结方组，于接种后次日开始每只裸鼠灌服消痰散结方浓缩煎剂0.4ml/次（相当于生药9.2g/kg体质量）1次/d，连续灌胃6周。空白荷瘤对照组，亦于接种后次日开始每只裸鼠灌服生理盐水0.4ml/次，1次/d，连续灌胃6周。化疗组，5FU以生理盐水稀释成7.5mg/ml，参照文献及本组以往研究经验按60mg/kg腹腔注射，1次/周，连续用药3周。　　1.2.3移植瘤生长、小鼠活动及营养状况观察接种后观察小鼠活动、进食及营养情况。6周后

6、拉颈处死裸鼠,从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤质量。运用公式抑瘤率（%）＝（对照组治疗后平均瘤质量－用药组治疗后平均瘤质量）/对照组治疗后平均瘤质量×100计算抑瘤率。完成观察及称取质量的瘤组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片。　　1.2.4移植瘤组织PA、EGFR的测定SP法，苏木素伊红染色，石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原。每张切片滴加一抗（鼠抗人PA、EGFR）1滴，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次后滴加生物素化二抗，每张切片上加1滴抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶溶液，3，3

7、'二氨基及联苯胺底物显色10min，二甲苯透明，中性树胶封闭。PA染色阳性物质呈棕黄色，颗粒状，位于胃癌细胞核内，在×200油镜下，随机计数200个以上的细胞作为分析基数，计数标记PA指数，即被标记细胞在一细胞群中所占的百分率。EGFR阳性染色大多位于胞浆及胞膜上，个别位于胞核上，为棕黄色颗粒，按染色深度和阳性细胞所占比例分别计分。（1）染色深度：0分，无着色；1分，浅着色；2分，深着色。（2）阳性细胞比例：0分，无着色；1分，着色≤1/3；2分，1/3＜着色≤2/3；3分，着色＞2/3。两项结果相加＞3分为阳性。

8、　　1.3统计学处理采用多个样本均数间两两比较F检验与不配对资料t检验，不同组间表达比率采用四格表资料的χ2检验，运用SPSS10.0统计软件处理。　　2结果　　2.1消痰散结方对裸鼠MKN45胃腺癌生长的影响荷瘤对照组在MKN45人胃腺癌接种于裸鼠皮下后14d左右，腹部开始触及结节型肿块，以后逐渐增大。中药组晚于对照组触及肿块，化疗组又稍