复元胶囊对实验性骨关节软骨细胞凋亡及bax和bc

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1、复元胶囊对实验性骨关节软骨细胞凋亡及Bax和Bc【摘要】目的观察复元胶囊对大鼠膝骨关节炎模型软骨细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的影响，探讨其治疗骨关节炎的作用机制。方法48只雄性SD大鼠随机分成正常组、模型组、壮骨关节丸组、复元胶囊组，每组12只。除正常组外，其余各组采用Hulth法建立膝骨关节炎动物模型。4周后，壮骨关节丸组、复元胶囊组分别给予壮骨关节丸、复元胶囊灌胃，而正常组、模型组给予生理盐水。8周后，取大鼠膝关节软骨作透射电镜观察细胞超微结构，原位末端标记法(TUNEL法)检测软骨细胞凋亡，逆转录/聚合酶链反应(R

2、T-PCR)法检测Bax和Bcl-2mRNA的表达。结果复元胶囊能抑制骨关节炎软骨细胞过度凋亡，降低促凋亡基因BaxmRNA表达，增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表达，并调节Bax/Bcl-2的比例。结论复元胶囊通过降低促凋亡基因BaxmRNA表达、增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表达、调节Bax/Bcl-2的比例而抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡。【关键词】膝骨关节炎;细胞凋亡;复元胶囊;Bax;Bcl-2骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是临床常见的、严重影响中老年人生活质量的一种慢性、进行性关节疾病，关节软

3、骨退行性改变是OA发病的中心环节。近年来研究报道，软骨细胞凋亡在关节软骨退行性改变过程中起着重要作用[1，2]。复元胶囊是临床上长期用于治疗骨关节炎有明显疗效的中药复方实验制剂，但是其分子水平的作用机理尚不十分清楚。本实验采用Hulth法制造大鼠膝关节实验性骨关节炎动物模型，以临床上常用于治疗骨关节炎的中成药壮骨关节丸作对照，观察复元胶囊对大鼠膝关节实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，检测Bax和Bcl-2mRNA表达的变化，旨在研究复元胶囊对骨关节炎的治疗作用，探讨其作用机制。1材料与仪器1.1药物复元胶囊由人参、淫羊藿、鹿茸

4、、黄芪、川芎、当归、枸杞子等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，仅供实验使用;壮骨关节丸，由深圳三九药业股份有限公司生产，批号：Z44023377。1.2动物雄性成年SD大鼠48只体质量(200～250g)，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)2002007。1.3试剂TUNEL试剂盒购自美国Roche公司;蛋白酶K购自美国sigma公司;DAB显色试剂盒购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司;RNA提取试剂TRIZOL购自Invitrogen公司;两步法RT-PCR试剂盒购自TaKaR

5、a公司;P53、caspase-3及内参GAPDH引物购自上海Sangon公司(引物序列见表1);DL2000型DNAMaker购自TaKaRa公司;DEPC水，sigma公司;琼脂糖粉购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司;GoldViein，共3周。2.3给药根据Meeh-Rubner公式计算大鼠的给药剂量。手术后第4周，复元胶囊组给予复元胶囊0.72g·kg-1·d-1(相当生药5.76g/kg/d)、壮骨关节丸组给予壮骨关节丸1.14g·kg-1·d-1配制成3ml溶液，正常组、模型组分别给予生理盐水3ml，每天灌胃1次

6、，共8周。2.4取材全部动物在12周末处死，立即解剖右侧膝关节，锐刀片切取1cm×1cm×1cm大小股骨内髁全层软骨，立即放入4℃2.5%的戊二醛中固定，供透射电镜观察用(透射电镜制作和观察在重庆医科大学电镜实验室完成)。再每组随机取5只大鼠切取股骨内髁于4%的多聚甲醛溶液中固定，供石蜡切片使用。余下软骨和胫骨平台的软骨用锐刀片切取，装入冻存管液氮中保存，用于RT-PCR检测。2.5TUNEL法检测软骨细胞凋亡参照Roche公司TUNEL试剂说明书操作，并设立阴性对照。阳性判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋

7、亡细胞。每张切片任取5个视野，高倍镜下计数阳性细胞和总细胞数，细胞凋亡指数(AI)=TUNEL标记阳性细胞数/软骨细胞数×100%。2.6RT-PCR法检测Bax、Bcl-2mRNA表达用TRIZOL提取各组软骨的总RNA。各组取1μl总RNA，逆转录合成cDNA，逆转录反应体系总体积10μl(含MgCl22μl，10×RTBuffer1μl，RNaseFreedH2O3.75μl，dNTPMixture1μl，RNaseInhibitor0.25μl，转录酶0.5μl，Oligo酶0.5μl)。取逆转录产物3μl进行PCR循

8、环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环，末次延伸10min，4℃保存)。反应完毕，取反应产物10μl于1.5%含50μl/LGoldVieRNA的相对表达量。2.7统计学处理各组数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件，采用单方向方差分析