环境雌激素mehp通过ros介导的线粒体损伤在trali中的作用机制研究

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1、环境雌激素MEHP通过ROS介导的线粒体损伤在TRALI中的作用机制研宄研究背景及目的：输血相关急性肺损伤(TRAL1)是一种罕见但可能致命的输血反应，是H前输血相关死亡的首要原因［1］。尽管TRALI的危害己经被人逐渐认识到，但对这种并发症的重视程度仍尚显不够［2］。目前TRALI的诊断根据临床症状主要是输血后6小吋内发生急性呼吸窘迫的非心源性肺水肿［3］。TRAU的病理生理机制第一步是涉及输血血液成分中含有献血者的血浆中存在的白细胞的抗体，最常见的人类白细胞抗体(HLA)1类和11型抗体，为受助人因濟在疾病引发的中性粒细胞［4］。第二步机制是涉及到中性粒细胞底

2、物激活的肺生物活性因子造成直接肺血管内皮损害，毛细血管渗漏和急性肺损伤［5,6］。无论哪种机制，最P释放哪种因子最后都是直接作用于肺血管内皮从而引起输血相关急性肺损伤。邻苯二甲酸二乙基已酯(DEHP)及代谢产物邻苯二酸-单2乙基己酯(MEHP)是环境雌激素(EEs)屮邻苯二甲酸酯类(PAEs)的一种，是在环境屮无处不在的内分泌干扰物。它作为塑化剂是在聚氯乙烯制成的塑料中存在，因为其使用广泛所以在不断的影响着人类生产和生活。作为一种塑化剂可以在人类羊水，脐带血,人类乳汁，精液，唾液检测到［7］。根据美国Swedish医疗中心2009年的一份研究报告显示：在使用血液袋

3、，输液袋等含邻苯二甲酸酯的医疗器械时，DEHP及MEHP吸收途径是由于血液袋内容物的静脉内给药直接吸收的。其使用液相色谱/质谱(LCMS)技术测量收集在献血中心(PRBC)袋的上清液DEHP和MEHP从第1天到有效使用日期42天的含量。结果显示DEIIP从第1天的34.3uM(20.0土SD)显著增加12.6倍至第42天的433.2uM(131.2±SD);MEHP显著从第1天的3.7uM(2.8±SD)增加20.2倍上升至第42天的74.0PM(19.1士SD)。由此可见使用库血制品中含量超标的的DEHP和MEHP可能是输血相关急性肺损伤(TRAL1)发生的一个

4、重耍因素。细胞凋亡作为细胞生物学在过去的10年研宄最多的领域之一，是细胞程序性死亡的主要的研宂形式，它在组织稳态发展过程中的核心作用。其中细胞凋亡的众多信号通路屮，Bcl-2家族蛋白是主要参与者。它们的主要功能是调节线粒体外膜（0MM）的通透性，释放不同的凋亡因子，即细胞色素C，Smac/DIABLO,0mi/HtrA2的，核酸内切酶$,和MF。Bax作为促凋亡蛋白与鉴定为抗凋亡蛋白的Bcl-2蛋0，同属Bcl-2家族。Bax蛋白通过诱导线粒体通透性转换孔，并刺激细胞色素释放f并激活下游凋亡信号通路导致细胞凋亡。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有：①拮抗促凋亡基

5、因bax;②抑制促凋亡的蛋白质细胞色素c自线粒体释放到胞质；③阻止胞质中的细胞色素c激活caspase;④有抗氧化及维持细胞内韩稳态等作用。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，Bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。为了探究MEHP（DEHP在人体内会转化生成MEHP）导致输血相关急性肺损伤（TRAL1）发生的原因和机制，我们建立体外细胞染毒模型，探讨MEHP对血管内皮细胞HUVEC的直接毒效应及其机制。试验方法和结果：实验方法：1、将HUVEC细胞在含10%胎牛血清浓度的1640培养基培养条件下，培养状态稳

6、定后，用不同浓度的MEHP（0、6.25、12.5、25、50、100^iM）染毒一定时间。2、用Mm、流式细胞术检测细胞的细胞活力和细胞凋亡率以检测MEHP对细胞的毒性作用。3、用DCFH-DA荧光探针、JC-1荧光探针等分别检测细胞胞内ROS的产生以及线粒体膜电位的变化。4、用试剂盒检测细胞胞内氧化砬激指标包括胞内丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽（GSH）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的情况。5、用酶标学的方法检测细胞凋亡可能存在的凋亡通路，检测caspase-3.caspasc-8、caspase-9三种酶的活力以验证内源性和外源性凋亡通路。6、用实时

7、荧光定量PCR方法检测细胞裂解液中Bax,Bcl-2的含量。7、Westernblot检测细胞裂解液屮Bax,Bcl-2,细胞色素-c蛋白质的表达水平。8、利用用还原剂NAC预处理后，通过检测ROS的产生、细胞活力和凋亡率，看ROS是否介导丫MEHP的毒效应。结果：1、细胞活力显著下降，细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。2、细胞内R0S的生成，随着浓度的增加，中、高剂量组胞内R0S的贪量明显增加。3、MEHP诱导HUVEC凋亡而导致胞内氧化应激指标紊乱。4、MEHP通过内源性和外源性途径共同诱导HUVRC凋亡。5、MEHP可以引起细胞内Bax和Bcl-2RNA水平的

8、改变。6、