hbv全基因组克隆转染细胞系的建立

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1、HBV全基因组克隆转染细胞系的建立赵艳芳，闫永平，苏海霞，王安辉，张磊，张景霞，门可，徐德忠【关键词】肝炎病毒,乙型；基因组,病毒；克隆,分子；转染；细胞培养；基因表达【Abstract】AIM:ToconstructaneforproducingHBVinvitro.METHODS:FulllengthHBVDNAedpcDNA33HBV).HepG2cellsmunocytochemicalstaining.SgenemRNAexpressionidpcDNA33HBVainlyinthecytoplasm.Sge

2、nemRNAexpressionecanreach1×108copies/LdetectedbyrealtimequantitativePCR.CONCLUSION:RebinantplasmidpcDNA33HBVcouldbeexpressed,transcribedandreplicatedinHepG2cells.ThistransfectionbasedcellculturesystemcouldproducehighcopiesofHBVgenome.【Keye,viral;cloning,moleculo

3、r;transfection;cellculture;geneexpression【摘要】目的：建立HBV体外细胞培养体系.方法：构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2细胞，G418筛选.ELISA检测细胞上清液HBsAg，HBeAg的表达，免疫组化检测细胞内HBcAg的表达，RTPCR检测细胞S基因mRNA的表达，PCR检测细胞上清液DNA.结果：成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2后，培养上清HBsAg，HBeAg阳性，细胞内HBcAg呈核浆型分布，且以浆

4、型分布为主.RTPCR证实有HBVS基因mRNA的表达，上清中HBVS及前S基因阳性，荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV滴度达1×108拷贝/L.结论：重组质粒pcDNA33HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制，该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.【关键词】肝炎病毒，乙型；基因组，病毒；克隆，分子；转染；细胞培养；基因表达0引言由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进展，且不能在体外人工培养，制约了对HBV的研究〔1〕.将HBVDNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型对研

5、究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义〔2-4〕.HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，其开放读框分布于全长DNA，为使完整的转染基因能在细胞内复制，目的基因的长度要大于一个HBVDNA单元〔5-6〕.我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒，转染细胞，以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型，并研究其产生HBV的水平.1材料和方法1.1材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位点中插入头尾相连的HBV（adr亚型）三连体，由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠，保存在大肠

6、杆菌DH5α中.真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠；人肝母细胞瘤细胞系（HepG2）由第四军医大学微生物学教研室惠赠，本室传代培养；内切酶EcoRⅠ,HindⅢ,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶,反转录酶及DNAmarker（TakaRa公司）；质粒提取试剂盒（西安市莱博科技发展有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；DMEM培养基，G418（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海

7、科华生物工程股份有限公司）；SABC免疫组化试剂盒，DAB染色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；S基因，βactin及HBV前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成.1.2方法1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养pUC193HBV和pcDNA3，以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3，分别以EcoRⅠ,HindⅢ单酶切pUC193HBV，以EcoRⅠ,HindⅢ双酶切pUC193HBV和pcDNA3，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，利用胶回收试剂盒回收9600bp

8、HBV全长基因片段和线性pcDNA3.1.2.2pcDNA33HBV重组质粒的构建及鉴定HBVDNA与线性pcDNA3以浓度比3∶1混合，在T4DNA连接酶作用下4℃连接16h.连接产物转化感受态细胞DH5α.随机调取抗性菌落，经小量扩增，提取质粒，分别以EcoRⅠ,HindⅢ单酶切并以二者双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远