大豆异黄酮相关基因的表达分析及gmbhlh3a基因的功能鉴定

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1、大豆异黄酮相关基因的表达分析及GmbHLH3a基因的功能鉴定第一章绪论1.1大豆异黄酮的研究上世纪90年代，美国癌症研究中心分离得到了大豆中五种具有抗癌活性物质，其化学成分分别是：胰蛋白酶抑制剂、植物甾醇、大豆皂苷、肌醇六磷酸和大豆异黄酮[1-2]。使得许多研究者将注意力转移到在大豆异黄酮的功效方面，致使近些年对于大豆异黄酮研究论文与日俱增。通过研究发现，大豆异黄酮在抗癌、抗氧化作用，人体雌性激素作用，调节心血管系统的作用及预防老年痴呆等生物功效[3]。大豆异黄酮与人体雌性激素的分子结构十分相似，具有弱的雌激素作用，其能够代替雌激素与相应受体

2、结合发挥雌激素的作用，同时又具有抗雌激素的作用[4]。大豆异黄酮行使代替或抑制雌激素的作用主要取决于人体雌激素的代谢水平，当人体雌激素水平过高时，显示抗雌激素功能；当人体雌激素水平较低时，则行使雌激素代替物的功效[5]。在女性绝经前后，体内的雌激素分泌水平大幅下降，引起人体组织器官之间不相适应，从而出现一系列病症[6]。大豆异黄酮很好的补充了这一阶段人体雌激素分泌不足的缺陷，从而使大豆异黄酮发挥了延缓女性更年期的功效[7]。大豆甙元含有7，4-二酚羟基，这部分结构可作为供氧体与分子自由基反应，熄灭自由基，从而终止自由基的连锁反应[9]。异黄酮

3、作为一种抗氧化剂，可以阻止人体的脂质过氧化过程，进而提高体内抗氧化酶的活性，从而使大豆异黄酮起到延缓人体衰老的作用；雌激素的分泌还可预防心脏病的发生，并且可促进人体甲状腺激素的分泌，从而使胆汁分泌增加，降低低密度蛋白胆固醇，预防动脉硬化的发生[8]。..1.2bHLH转录因子的研究进展bHLH（basichelix-loop-helix）转录因子是一种在生物界中普遍存在的转录因子家族，也是植物中最大的转录因子家族之一[27]。这类转录因子保守结构域含有一个α螺旋-环-α螺旋的HLH结构域，这一结构域由15~20个相对保

4、守的氨基酸组成[28]，当bHLH转录因子进入到细胞核时能够特异识别并结合DNA的E-box（5'-CANNTG-3'）序列，同时，绝大多数的bHLH转录因子特异结合G-box(5'-CACGTG-3')序列[29-30]。HLH还能够促使bHLH转录因子之间形成同基因的二聚体或和其它的bHLH基因形成异型二聚体[31]。Toeldo-Oritz等[32]将拟南芥的bHLH转录因子分为12个主族和21个家族。而Li[32]将水稻的bHLH转录因子分为22个家族。到目前为止，植物bHLH转录因子的家族分类还没有具

5、体的定论，但MYC类作为bHLH转录因子家族中的一个亚族是被普遍接受的，在这一类亚族基因的N端含有bHLH_MYC的保守结构域。MYC转录因子特异识别G-box序列。在拟南芥编码的162个bHLH转录因子中，约10%的基因已经被人们的研究所涉及到[35-37]。玉米的R基因是第一个被发现的bHLH转录因子基因[38]。R基因属于bHLH转录因子中MYC类亚族中的基因，这一转录因子家族中包含B类和R/B类两种基因，研究发现这些基因具有调控植物花青素在不同植物组织中积累的功能[39]。这些基因通过和R2R3-MYB转录因子C1相互作用形成转录因子

6、复合体而参与调节植物花青素生物合成，并且能与相应的G-box序列结合进而调节花青素合成酶基因的表达[40]。另外，bHLH-MYC转录因子会通过形成（MYB-bHLH-YC2a基因的克隆及序列分析.........374.1材料..........374.2方法..........394.3结果与分析...........444.4讨论..........48第五章GmbHLH3a基因功能的初步分析.........505.1材料...........505.2方法...........525.3结果与分析...........595.4讨论

7、..........627.4讨论将GmbHLH3a基因转化豆科模式转化系统，通过qRT-PCR和荧光显微镜检测得到转化pCAMBIA1300h–GmbHLH3a和pCAMBIA1300h的阳性大豆发根。利用高效液相色谱法测定大豆异黄酮含量，发现过表达GmbHLH3a大豆发根的异黄酮组分含量普遍提高。结果表明，GmbHLH3a基因具有调控大豆植株异黄酮含量积累的功能。大豆异黄酮各组分之间的比例并没有改变，黄豆苷的含量最为丰富。GmbHLH3a基因的过表达能够调控大豆发根的异黄酮含量积累，但是并没有改变大豆各组分之间的含量。GmbH

8、LH3a可能参与调控大豆异黄酮合成相关基因，最终并没有改变参与大豆异黄酮各组分合成的下游酶基因的表达量，但是不排除其改变了IFS、HID、CHI、CHS、IF7GT