绿色荧光蛋白分子标记的研究现状

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1、绿色荧光蛋白分子标记的研究现状王枝平赵天吉马胡坚2012311535摘耍近年来，来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研宄手段。其中，来源于水母的绿色焚光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法，对于目前在各个研究领域有很好的应用价值。目前，GFP在微生物降解污染物、环境生态学和环境检测生物等领域取得了很好的应用效果。关键词绿色荧光蛋白分子标记应用价值序言近年来，荧光蛋白基因标记技术是迅速发展的一种新型细胞示踪技术。其中，绿色焚光蛋白(greenfluorescencepro

2、tein,GFP)是应用最广泛的标记基因，在GFP基因标记后，在特定波长激发下，细胞可以强烈而持久地发出绿色荧光，同时保持良好活性，体内单个荧光细胞亦可用多种方法敏感地检测出来。GFP是一种良好的标记物，表达对寄主细胞无毒性作用，可连续培养。表达后，能自发产生荧光蛋白，可借助荧光体视镜和荧光显微镜进行活体实时定位观察。目前，GFP己被广泛应用到真菌的研究中，并也取得了前所未有的成果传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上，但是化学计量和染料附着的部位难于控制，因此尚需再次纯化。正是由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质，且该基因在异源细胞内

3、的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光，使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。-：绿色荧光蛋白的基本结构与性质绿色荧光蛋白(GFP)是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)最早是由Shimomure[3]等在1962年时由多管水母中提取而来.后来Prasher等人在1992测得，为238个氨基酸残基组成，4?Ax?4A分子量约27kDa。其折叠结构为一(高X直径)的(3简状结构，筒状结构两端由一些较短的螺旋盖住，生色团位于筒状结构中央，生色团完全被包覆，处于P筒状结构内部的氢键M络中，三

4、维结构的形成与生色团的固定以及GFP的荧光冇非常紧密的关系:一是保护了生色闭免遭分子氧的淬火；二是防止生色团形成过程屮处于激发态的屮间体的构象翻转％。191-1野生义绿色荧光蚤白的三级纺构：生色团碳原子、氣原子和氣原子的顏色分別为白色、篮色和红色(a)渌色荧光蛋白包復生色田形成的荈状蛄构体：(b)嵴说®二GFP的生物发光原理早在六十年代初期，Shimomura等［3］首先从多管水母属(Aequoreavictoria)中分离出一种称为Aequorea的蛋白，该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光，当时称为光蛋白(Photoprotein)。它是分了量为20k

5、D的单一多肽链，在其发光前，IMol的Aequoria结合3Mol的钙离子及IMol非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋0体系本身发射蓝光，然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色，推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色$光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)。Morise等⑷对GFP进行了分离和纯化，他们的实验结果表明，GFP的荧光发射峰在509nm,最大激发波讼为395nm,并在475nm处有一肩峰。当将Ca2+加入到含低浓度GFP的Aequorin溶液屮时，光谱接近于Aequorin发射的蓝光(Kmax472nm);而

6、将Aequorin和GFP按大自然比例混合时，加入Ca2+,则光谱接近于活体的发射光(Kmax509nm)。推测在活体内，GFP通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程，吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光［5］。总的说来，Shinonura在发现GFP中作出了重要的贡献，如对其纯化和物理化学表征等方面，以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等.他们说明了GFP可以作为一种能量受体以及Aequorin作为能量给体，而在二者间发生了Forster的能量转移，并解释了由GFP发射的是绿光而不是蓝光.他们还正确的指认了与GFP多肽链体的发色团的不同功能部分.

7、而如果没有这些Shimomura幵创性的经典工作，冇关GFP的出现和广泛应用将推迟几十年，其至至今它仍作为一种秘密保留在太平洋中［111］。三：绿色荧光蛋白分子标记技术由于绿色荧光蛋白分子受到蓝光照射时会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，可以用绿色荧光蛋白来标记儿乎任何生物分子或细胞，作为一种新型的报告基因。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging),即利用DNA重GFP标记的微管组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质

8、进行细胞内活体观察。而且GFP的荧光产生不需要任何水母中特别组分的参与，蛋白质序列木身已经包含了GFP发光所