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1、慢病毒载体介导的RNA干扰抑制TLR基因的表达【关键词】小鼠;慢病毒感染;RNA干扰;TLR2;TLR4 【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatethetransfectionefficiencyofRNAmediatedbylentivirusandintereferenceeffectsonTLR2orTLR4geneinmousecells.Methods:AccordingtotheknoediatedRNAinterferenceisaneffectivemeanstosilentgeneexpressionandcouldbeuse
2、dinthestudyoffunctionforTLRgeneinmousesoastomeasuresomeprotenandtorevealitseffets. 【KEYice,Lentivirusinfections,RNAinterference,TLR2,TLR4 一直以来，人们对于固有免疫及其炎症反应的信号通路尚未完全阐明，近年来，随着果蝇Toll蛋白的发现，人们发现在哺乳动物和人类也存在着一类与果蝇Toll蛋白相似的跨膜蛋白，即Toll样受体(toll-likereceptor,TLRs),在免疫及炎症反应的信号传导中扮演重要的角色[1]。吞噬作用是宿
3、主固有免疫抵御外来入侵病原微生物的另一个关键因素[2]。由巨噬细胞引起的吞噬作用和随后的病原体降解在宿主应对微生物感染的固有免疫中发挥了枢纽的作用。最近的研究表明，TLRs在通过上调巨噬细胞的吞噬活力和促进细菌的清除中发挥重要的作用[3]。RNAi(RNAinterference)技术的出现,为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具[4]。我们在已经获取TLR基因的RNAi有效靶序列的基础上,设计、构建和鉴定表达TLRsiRNA的慢病毒载体,为研究TLR基因在巨噬细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。 1材料和方法 1.1材料和试剂三羟甲基氨基甲烷(北
4、京鼎国生物技术有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青公司),小鼠OPN一抗、小鼠STAT3一抗、小鼠B-actin一抗(美国SantaCruz公司)。病毒包装质粒由上海吉玛生物公司合成。 1.2慢病毒RNAi表达载体的构建 1.2.1针对TLR2或者TLR4干扰序列的设计及编码siRNADNA模板的体外合成 1.2.2siRNA靶位点的选择 根据GeneBank小鼠的TLR2或者TLR4基因mRNA的已知序列，在寻找符合特征的靶序列。靶序列寻找的基本指导原则：ATG下游25nt开始，寻找AA(N19).序列，如果没有合适的序列，寻找NAR(N17)YNN,Risa
5、purine(A,G),andYisapyrimidine(C,U).;G-C含量在36%~52%;正义链的3′端要有相对低的稳定性，在其15-19的位置至少要有一个AorT;避免4个或多个同一核苷酸重复，特别是T的重复，因为polyT是一种RNA聚合酶Ⅲ终止信号;一个基因需要设计3~4个靶序列的siRNA。 1.2.3编码siRNADNA模板的体外合成 选择3-4个靶位点,用blast软件进行序列同源性分析,并用RNAstructure4.2软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括21个碱基正义链和与其互补的21个碱基的反义链,正反链之间有6个碱基(CTCGAG
6、)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号。 由上海吉玛生物公司合成,将合成的寡核苷酸用ddH2O配成20μmol/L，按照以下体系进行混合：5μLForin后，然后自然冷却至室温，获取双链。 1.2.4pLKO.1scrambleshRNA载体线性化及回收 将pLKO.1scrambleshRNA用AgeI和EcoRI双酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，测定线性化载体浓度。 1.2.5载体与siRNA模板链连接 连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3~5∶1，充分混匀，加入T4连接16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。 1.2
7、.6连接产物的转化 取100μL的感受态细菌，加入pLKO.1scrambleshRNA与siRNA连接产物，轻轻旋转混匀,冰浴30min，42℃热休克90s，快速放置冰浴中2min，加入800μLLB培养基(不含Amp)，37℃振荡培养60min，吸100μL培养液滴于含Amp的LB平板涂匀，待表面液体吸收后，倒置平皿37℃培养16~20h。 1.2.7阳性重组克隆的筛选 挑取单个菌落，接种于3mL含Amp(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日取1.5mL于Eppendorf管中，10000rpm离心1min
