诊断分子生物学基本技术

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1、诊断分子生物学基本技术诊断分子生物学基本技术基础知识实验基础诊断技术临床应用amprΒ半乳糖苷酶N端编码序列变性与复性（denaturationandrenaturation）变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即变性增色效应解链过程中，DNA的A260增加，并与解链温度有一定的关系，这重关系称为DNA的增色效应复性变性DNA在适当的条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象即复性退火热变性的DNA经缓慢冷却即可复性，这一过程称为退火解链温度

2、Tm(meltingtemperature)解链曲线在连续加热DNA过程中，以温度对A260的关系作图，所得曲线称为解链曲线解链温度Tm在解链曲线中，紫外线吸收值达到达50%时的温度为Tm。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被打开Tm的影响因素碱基组成与G+C比例有关，G+C比例越高，Tm值越高实验条件例如三氯醋酸存在使Tm变小，氯化钠存在使Tm升高基因载体（genevector）概念把目的基因导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。特点自我复制遗传标记插入位点种类质粒噬菌体病毒DNA连结酶（DNA

3、ligase）概念连接DNA链3`-OH末端和相邻DNA链的5`-P末端，生成磷酸二酯键而形成完整的DNA链种类T4噬菌体DNA连结酶T4噬菌体RNA连结酶大肠E.coliDNA连结酶作用连接粘端连接平端目的基因（targetgene）概念需要研究的基因叫目的基因。来源基因文库存在于转化菌内、由克隆载体所带的所有基因组DNA的集合。化学合成法用DNA合成仪利用化学原理合成该核苷酸序列。cDNA以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA。聚合酶链反应在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DN

4、A。核酸的分离与纯化（theseparationandpurificationofnucleicacid）细胞的溶解因标本而异用SDS、Tritonx-100、超声破碎等核酸的分离苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，将核酸分离核酸的提取冷乙醇或异丙醇沉淀核酸，离心回收核酸去除杂质70%的乙醇洗涤沉淀，除去处多余的盐类核酸探针的标记（thelabellingprobeofnucleicacid）概念对已知碱基序列的单链核酸用示踪物进行标记得到核酸探针示踪物分类放射性核素类优点：灵敏度高、特异性

5、高、不影响酶促反应。缺点：污染环境、损害人体。非放射性核素类抗原抗体免疫标记物地高辛、亲和配体标记物生物素、荧光标记物FITC、电子密度标记物胶体金等。标记方法缺口平移法随机引物法末端标记法缺口平移标记法（Thelabelmethodofnicklevelmoving）概念由DnaseⅠ在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5`端核苷酸和3`端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链，合成与模板互补的新链。优点快速、简便、成本相对低、比活性较高、标记均一，大分子标记效

6、果好（﹥1000bp）。缺点单链DNA、RNA、﹤200bp不能用该法标记。﹤随机引物标记法(Thelabelmethodofrandomprimer)概念采用6个核苷酸的随机引物与模板DNA结合的原理将标记物掺入到新合成的DNA片段中去，完成探针标记反应。随机引物是指有各种可能排列组合顺序的混合物，能与任何核酸序列退火杂交，并为DNA聚合酶的反应起到引物作用。方法将双链DNA变性为单链，与随机引物退火杂交，在含有dNTP底物的示踪物的存在下，由Klenow片段催化下，从引物3`末端开始按5`-3`方向

7、合成新的互补DNA链，即标记的DNA探针。优点具有缺口平移标记法的优点，而且能标记任何长度的DNA及RNA。末端标记法（Theend-labellingmethod）概念用核酸修饰酶对核酸片段的5`或3`末端进行部分标记，不对全长标记。分类Klenow片段末端标记法在有标记的dNTP存在下，Klenow片段可以填充双链DNA凹陷的3`末端，获得标记的DNA探针。T4DNA聚合酶置换合成标记法利用T4DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶和5`-3`核酸内切酶的作用，使3`末端凹陷，加入有标记的dNTP，获得

8、标记的DNA探针，用于末端为3`突出粘端和平端的情况。T4多聚核苷酸激酶标记法T4多聚核苷酸激酶可将[γ-32P]ATP的[γ-32P]转移到DNA游离的5`-OH上，还可催化γ-32P与5`末端的磷酸基团交换，因此无论是否5`末端去磷酸均可用此法标记。分子生物学实验诊断技术核酸扩增技术核酸杂交技术多态性的分析核酸序列分析DNA重组技术杂交核酸技术（Thehybridizationtechniqueofnucleicacid）核酸分子杂交在