牛蒡叶中绿原酸提取与纯化工艺研究

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第一章文献综述蛋白和含铁酶、传递电子和氧、维持器官生理功能等作用；锰在酶激活、增强蛋白质代谢、合成维生素、防癌等方面有重要功效；其多酚类物质具有抗癌、抗突变的作用，因而具有很高的营养价值和较广泛的药理活性。每百克牛蒡嫩叶中含蛋白质4.7g，脂肪0.8g，碳水化合物3g，粗纤维2.4g，胡萝卜素3.9mg，维生素B0.02mg，维生素B20.29mg，烟酸1.1mg，维生素C25mg，钙242mg，磷61mg，铁7.6mg。牛蒡叶中含有木脂体、绿原酸等，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂[9]及抗氧化性[10]的功能；木脂体具有抗肿瘤、抗病毒等多种重要生物活性和药理作用[11]；牛蒡茎、叶中含有较多的菊粉。菊粉在人的胃和小肠不能被酶消化，而直接送入大肠，能促进双歧杆菌、乳酸杆菌的生长和活动并抑制有害菌的生长，同时具有调血脂、降血糖、免疫调节和抗肿瘤等生理活性[12]。牛蒡子是菊科牛蒡属植物牛蒡的种子,为常用药始载于《名医别录》,名曰恶实,列为中品。《本草图经》始称牛蒡子,别名大力子。目前,以东北三省产量最大,称作“关大力”。另有浙江桐乡产者质佳,称为“杜大力”。其性辛，苦,寒,归肺，胃经。具有疏散风热,宣肺透疹,解毒利咽功能。用于风热感冒,咳嗽痰多,麻疹,风疹,咽喉肿痛,痄腮丹毒,痈肿疮毒[13]。牛蒡子还含有牛蒡苷、牛蒡苷元等有效活性成分[5]。牛蒡作为一种经济作物，有“蔬菜之王”、“白肌人参”、“大力参”等美誉。《现代中药大辞典》中将牛蒡的药理作用概括为“抗菌、抗癌、抗衰老”三大功效。早在李时珍的《本草纲目》中就详细记载其能“通十二经脉、除五脏恶气”，“久服轻身耐老”。也就是说：经常食用牛蒡可以减肥、抗衰老。美国著名保健专家史尔·施德尔博士在《抗衰老圣典》一书中写道:牛蒡的根部受全世界人的喜爱，它是一种可以帮助身体维持良好工作状态，老幼皆宜的温和营养草药。牛蒡可每日食用而无任何副作用，而且对体内系统的平衡具有复原功效。日本熊本大学医学部前田博士认为牛蒡的保健功能在于可消除和中和有害人体健康的“活性氧”，因为“活性氧”不仅是致癌的因素,也是动脉硬化和老化的原因之一。牛蒡的药用价值和食用价值越来越受到人们的重视，牛蒡或牛蒡提取物作为营养保健原料已被广泛用于食品和药品[14-19]。目前牛蒡保健品牛蒡酒、牛蒡饮料、牛蒡茶、牛蒡罐头等的市场需求越来越多，并且不断有新的牛蒡保健食品被研究开发和生产。目前，牛蒡作为一种新、特蔬菜，出口日本及欧洲等国，而牛蒡叶作为牛蒡副产品，除民间应用外，绝大部分被作为废物处理掉。同时牛蒡的多种生理活性和药理作2 第一章文献综述用，引起医学界和天然产物研究者的关注。1.2绿原酸的研究概况1.2.1绿原酸的理化性质和结构绿原酸(chlorogenicacid)是由咖啡酸(caffeicacid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinicacid)组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinicacid),分子式:C16H18O9,分子量:345.30，熔点是208℃，它的半水化合物为白色或微黄色针状结晶。绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[20]。绿原酸分子结构如图1-1。HOCOOHOHHOOOCCHCHOHOH图1-1绿原酸的分子结构Fig.1-1Molecularstructureofchlorogenicacid绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。在从植物提取过程中，往往通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。绿原酸为极性有机酸，不稳定[21-22]。在提取过程中，通过水解和分子内酯基迁移发生异构化[23]。绿原酸的邻二羟基结构不稳定，受热、见光容易氧化分解[24]。在碱性环境也不稳定，容易水解。绿原酸存在异构体。刘艳清等[25]对苗圃型、洛阳苗嫁接型、密叶型、古坑成林型四个品种的杜仲中绿原酸类物质进行研究发现，不同品种杜仲，绿原酸异构体的数量和类型不相同。1.2.2绿原酸的生物合成[26]植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下,葡萄糖转化成莽草酸(shikimicacid),后者再转化成苯丙氨酸,最后经合成酶作用得绿原酸。其可能的生物合成途径如下:3 第一章文献综述图1-2绿原酸可能的生物合成途径Fig.1-2Possiblebiosyntheticpathwayofchlorogenicacid1.2绿原酸的生物活性绿原酸具有广泛的生物活性,对自由基的清除和抗脂质过氧化作用显著，具有抗菌、抗病毒、抗诱变、保肝、利胆等多种药用功能。1.2.1对自由基的清除及抗脂质过氧化作用[27]绿原酸是一种活性很强的抗氧化剂,可有效清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基。马建华等[28]研究表明：绿原酸不仅快速消除羟基自由基，而且有效通过电子转移修复脱氧鸟苷酸氧化性羟基加成自由基。H2O2CTMAB鲁米诺发光体系证明,金银花水提物绿原酸在体外对H2O2有直接的清除作用,且呈线性量效关系[10]。石爱华等[29]在猕猴桃果仁油中添加一定量的绿原酸，能有效提高果仁油的抗氧化稳定性。1.2.2对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用透明质酸酶(HAase)是裂解粘多糖的酶之一,可催化透明质酸(HA)的分解,关系到血管系统的通透性和炎症反应。从天然产物中发现绿原酸抑制透明质酸酶激活的活性成分,有望开发为新的抗变态反应药物[30]。绿原酸还被确认为是大鼠肝微粒体中葡萄糖-6-磷酸位移酶(Glc-6-Ptranslocase)第一个新型特异性抑制剂[26]。给大鼠肝脏灌注绿原酸表明,对糖原异生和糖原分解呈剂量依赖性抑制,葡萄糖-6-磷酸酶作为这类化合物对肝糖产生抑制作用的干扰靶标。在绿原酸及其合成类似物存在下,测定正常大鼠肝微粒体中葡萄糖-6-磷酸水解程度,来评价这些化合物对位移酶活性的抑制强度[31]。1.2.3抗菌、抗病毒等作用绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。绿原酸和绿原酸锌配合物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗菌活性。绿原酸对引起龋病的变形链球菌、放线粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌、牙龈炎杆菌4 第一章文献综述及伴放线嗜血菌显示较强的抑菌活性。德国Free大学E.Eich教授认为绿原酸是有希望成为抗艾滋病毒(HIV)的先导化合物[32]。绿原酸的水解产物咖啡酸也具有止血、利胆、抑制单纯疱疹病毒之功效。1.2抗诱变作用绿原酸具有较强的抑制突变能力,它可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素B1和苯并[a]芘的变异原性[33-34]并且有效降低射线引起的骨髓红细胞突变。Abraham等[35]研究发现CHA抑制C2射线诱发小鼠骨髓细胞小核。近来日本学者证实了杜仲茶的变异原性抑制作用与杜仲叶所含的CHA等抗变异原性成分有关[36-37]。绿原酸可以通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中运输,达到防癌、抗癌的效果。日本一大学研究组发现含有普通浓度绿原酸的咖啡可以抑制老鼠身上培养肝癌细胞的扩散。1.3对心血管作用从苦丁茶中分得的异绿原酸B和C,异绿原酸B对大鼠有较强促进前列腺环素(PGI2)的释放和抗血小板凝集作用；异绿原酸C也有促进PGI2释放作用。此外,对血小板血栓素生物合成和氢过氧化物诱导的内皮素细胞损伤有极强抑制作用[38]。1.4保肝利胆作用绿原酸对消化系统、血液系统和生殖系统均有药理作用,具有利胆、降压、抗菌、消炎及升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用[39]。娄红祥等从金银花水溶性部分经乙酰化后分得绿原酸四乙酰化物,经药理实验表明,对CCl4引起小鼠肝损伤有明显的保护作用[40]。1.5食品保鲜作用绿原酸用于食品和果品具有增香、护色和保鲜作用。高锦明等[1]研究发现,绿原酸大大提高草莓等果汁稳定性。刘军海等[41]认为绿原酸可用绿原酸制作保健食品或饮料。在猪油中，若添加少量绿原酸，可提高猪油氧化稳定性，增长贮存期。将少量绿原酸加到天然色素溶液中，对色素颜色有稳定作用。因此，绿原酸又是一种良好的食品添加剂。1.2.1绿原酸的提取方法由于绿原酸结构中有酯键、不饱和双键及多元酚等不稳定因素，在提取过程中，因水解和分子内酯基迁移易发生异构化。因此提取时应避免高温、强光及长时间加热。1.2.4.1水提法5 第一章文献综述水提法是利用绿原酸易溶于水之特性，用热水作为浸提剂进行提取方法。水提工艺简单、成本低、投资少。王茜等[42]探讨了水以及不同浓度乙醇，甲醇和丙酮水溶液作为提取溶剂对绿原酸得率的影响，对影响绿原酸提取率的主要因素进行分析表明，50℃水提取绿原酸得率比较高，其得率为1.06%；刘祥兰[43]分析得知，采用10倍加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5h，其绿原酸的含量明显高于其他条件的含量。但水提法能耗高、生产周期长、废水量大；且在提取时，大量水溶性物质如蛋白质、多糖、鞣质、粘液等杂质析出，过滤十分困难，因此产品纯度低。1.2有机溶剂提取法绿原酸易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性。徐建国等[44]用乙醇提取绵茵陈中绿原酸的效果较好，确定的最佳乙醇浓度为60%；乌兰等[45]用从金银花中提取绿原酸表明：用70%乙醇热回流提取是金银花中绿原酸提取的最佳方法。有机溶剂提取法需要能量消耗少，产品得率高且纯度高，其粗产品易分离纯化。有机溶剂提取工艺简单，投资小，适合产业化生产；但由于使用有机溶剂，增加溶剂回收成本。1.3物理场强化提取法物理场强化提取法就是传统溶剂萃取中加入某种物理场，如超声波或微波等，强化萃取，减少萃取时间，降低活性物质降解。超声波是一种均匀的球面机械波,它在液体内部产生强烈的冲击波和微射流,击碎细胞壁使细胞内组分渗透到溶液中,从而达到分离的目的。周军等[46]研究发现超声波法的提取率明显高于传统溶剂提取法。尹波[47]实验结果：超声波法的提取率大大高于水提法，所需时间比直接用水提法所需时间缩短一半。超声波法成本低、污染小,无水提法难以过滤的制约因素,也无醇提法中因使用溶剂而带来的不利之处,工艺简易,适于工业化生产,但目前工业化生产技术还不成熟,有待于进一步研究.微波辅助萃取是在传统有机溶剂萃取技术基础上发展一项新型萃取技术。其特点是在植物内部迅速加热，使内部组织在很短时间内破裂，显著降低溶剂用量，减少提取时间，提高收率。凌伫怡等[48]优化的微波辅助萃取野菊花绿原酸结果明显高于传统加热回流提取。1.4超临界萃取法绿原酸热稳定性较差,不能在高温下操作,以超临界CO2为溶剂提取绿原酸,可以通过调节压力来控制操作温度,而且超临界提取法将萃取和蒸馏合为一体,可以节省能源,制取的产品纯度也高.但设备投资和维护费用较高,目前此方法还没有大规模应6 第一章文献综述用于工业生产。1.2酶法酶法是采用纤维素酶和果胶酶等分别或联合处理药材，然后再醇提的一种提取方法。陈永胜等[49]结果表明，纤维素酶和蛋白酶联合作用能显著提高绿原酸的提取率，绿原酸提取率达到1.90%。梅林[50]用纤维素酶3.0%提取金银花可提高绿原酸得率为1.2.1%。但采用酶法处理，大大增加生产成本，其经济可行性有待于进一步研究。1.3超滤膜分离法超滤法是以选择性透过膜为分离介质,在外界压力作用下,使小分子如绿原酸等透过膜,而大分子如蛋白质、多糖等则不能透过膜,从而达到分离、提纯的目的。该方法优点是能保留有效成分,操作方便,能耗低,分离效率高,无二次污染,可在常温下进行操作；其缺点是对提取液预处理要求高,产量易受膜条件的制约,而且膜被污染后清洗比较麻烦。1.4大孔树脂吸附法大孔吸附树脂是一种不含交换基团、具有大孔结构的高分子吸附剂,也是一种亲脂性物质,具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快、操作简单、产品质量稳定、生产成本低等优点,所以特别适合于分离提纯水溶性化合物。目前应用于纯化绿原酸的吸附树脂主要有NKA29型树脂、D101型树脂、D140型树脂以及XDA25型树脂,但是该方法耗用时间长,清洗吸附树脂比较困难[51]。1.2.4.1绿原酸的用途1.2.5.1食品行业绿原酸具有较强的药理活性，研究表明它对消化系统、血液系统和生殖系统均有药理作用，具有广泛的抗菌消炎、利胆、抗病毒、止血增加白血球、缩短血液凝固和出血时间以及兴奋中枢神经系统的生理功能。绿原酸可用于制作保健食品和饮料。另外绿原酸具有增香和护色作用，可用于食品和果品保鲜。绿原酸用于果汁的保鲜。可有效防止饮料和食品的腐败变质；高锦明等[20]研究发现,绿原酸大大提高草莓等果汁稳定性。天然的食品抗氧化剂越来越受到消费者的欢迎，绿原酸就是一种新型高效的酚型天然抗氧化剂。它在某些食品中可代替或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。在猪油中，若添加少量的绿原酸，可提高猪油的氧化稳定性，增长贮存期。将少量绿原酸添加到天然色素溶液中，对色素有稳定作用，因此绿原酸又是一种良好的多7 第一章文献综述功能食品添加剂。美国州立大学发现向日葵中绿原酸通过抗氧化性作用可预防心血管疾病、糖尿病及癌症的发生[52]。绿原酸在食品工业中显示越来越多的功能，也在保健食品的开发和利用方面显示重要作用。1.2医药行业绿原酸是许多中草药及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中药制剂质量控制的主要指标之一[53-54]。卫生部《药品标准》中具有抗菌消炎的药品170多种，均含有绿原酸。很多抗菌消炎产品中，对于效果的好差直接用绿原酸作为质量控制的指标，绿原酸含量高，产品质量好。魏东[55]利用大白鼠进行动物实验，研究发现富含绿原酸的牛蒡有抗氧化、降血脂保健作用。绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。绿原酸和绿原酸锌配合物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗菌活性。绿原酸对引起龋病的变形链球菌、放线粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌、牙龈炎杆菌及伴放线嗜血菌显示较强的抑菌活性。因此开发高纯绿原酸在医药行业具有巨大的经济效益和医学意义。1.3日用品行业我们买的化妆品中已经开始含有绿原酸。日本利用绿原酸的抗氧化性已经制出含有绿原酸的护肤品，并得到广大使用者好评。有研究发现绿原酸和天然抗氧剂一样，可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基的损害，有效防止紫外线对人体皮肤的伤害[56]。因此绿原酸可以添加到防晒霜中，经常使用含绿原酸的护肤品可以美白肌肤。1.2.1展望绿原酸作为一种重要的生物活性物质已受到广泛关注，已广泛应用于食品、药品和化妆品领域。绿原酸在药理活性、保健功能等领域的研究成果预示着开发含有绿原酸的药品、保健食品和日用化工产品具有良好的前景，因此寻找富含绿原酸的植物资源成为解决原料来源的一大问题。在自然界中，绿原酸虽然广泛分布于许多植物中，但含量较高的植物并不多见。目前绿原酸的主要来源是从天然植物中提取,国外多是从生咖啡豆中提取,而我国以往一直是从金银花中提取。金银花是忍冬科忍冬的干燥花蕾，由于花蕾的产量低，迫切需要扩大药源。我国对于绿原酸的提取纯化以及开发利用水平还远远落后于发达国家，国内已经转向绿原酸的水解产物咖啡酸的生理作用的研究和绿原酸的提取纯化上,而国外注重新的生理功能的拓展[57]及可能的作用机制8 第一章文献综述的讨论。就经济而言，金银花在价格上属于较贵重的一种中药材，而作为废弃物的牛蒡叶中含有绿原酸已经得到证实[58]，从牛蒡叶中提取绿原酸可以降低绿原酸成本、扩展我国资源利用程度，是发展可持续道路重要举措。同时，加强废弃物的综合利用不仅可以使这部分废物变为宝贵的资源，而且能提高农民的经济收入，促进我国经济的健康发展。本论文主要研究从废弃牛蒡叶中提取绿原酸，针对目前国内绿原酸工业的发展现状，此研究主要着眼于如何改进绿原酸的提取工艺，使之更适合工业化生产的需要；如何降低生产的成本，减少环境污染，减少生产处理的步骤以提高得率，提高产品的纯度等。在优化提取绿原酸的基础上，同时分离纯化绿原酸。我国有着丰富的富含绿原酸的植物资源，我们应该把握优势,合理利用丰富的资源,大力开展绿原酸的提取纯化与绿原酸产品的研究开发，使它更加具有广阔的应用前景。9 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立绿原酸(chlorogenicacid)为咖啡酰奎尼酸衍生物，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是许多中药及茶叶质量控制的指标[53-54]。目前，绿原酸的测定方法有可见分光光度法[59]、薄层层析法[60]、高效液相色谱法[61]、反相高效液相色谱法等方法。这些方法均存在成本较高、操作繁琐等问题。反相高效液相色谱法是目前文献中涉及较多的分析方法，但高效液相色谱法测定绿原酸也有不足之处，一是色谱柱易污染、二是分离效率低。因此，必须探索一条实验条件容易控制，简单方便，可用于一般常规性实验时测定绿原酸含量的方法。本章根据有关文献建立硅胶板层析-紫外吸收分光光度法[62]。1.2实验材料与仪器1.2.1实验材料牛蒡叶(磨碎备用)购自江苏徐州绿原酸标准品(纯度98%)中国药品生物制品鉴定所食用乙醇(95%)上海久亿试剂公司正丁醇、乙酸、甲醇均为分析纯上海久亿试剂公司1.2.2实验仪器UV1102紫外/可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司AE260电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司FW型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司LD4-2离心机北京医用离心机厂KQ5200E超声波波清洗器昆山市超声仪器有限公司RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂SHZ-111型旋转真空泵上海亚荣生化仪器厂365-紫外分析仪上海科艺光学仪器厂薄层色谱硅胶预制板(10cm×20cm)烟台市化学工业研究所10 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立玻璃点样毛细管(0.5mm×100mm)华西医科大学仪器厂层析缸(2.6cm×9cm)回流提取装置等。1.2实验方法1.2.1薄板层析分析条件1.2.4.1点样、层析展开和显色将10cm×20cm硅胶板切割成2cm×5cm，点样于硅胶板正面，用玻璃点样毛细管点样，每点一次吹干，再点第二次，再吹干。然后用展开剂展开，展开后晾干。在365nm紫外灯下显色，绿原酸呈蓝色斑点。1.2.4.2展开剂的选择展开剂选择的原则是以溶剂的极性大小为依据的。一般说来，在同一种支持剂上，则极性大的溶剂的洗脱能力也越大。文献报道用于纸层析的绿原酸展开剂有：氯仿:甲醇:水体系和正丁醇:乙酸:水体系等；将以上展开剂体系配成不同比例，用玻璃点样毛细管点样在硅胶板上面，用所配置展开剂展开，观察展开结果。1.2.2UV分析条件1.2.5.1最大吸收波长的确定用电子天平称取绿原酸标准品0.0126g，用50%甲醇溶液溶解，在超声波中超声10min，定容于25mL容量瓶中，摇匀，吸取上述标准液1mL，用50%甲醇溶液稀释至10mL（以此作为母液），以50%甲醇为参比液，作空白实验。采用紫外可见分光光度计在220-400nm的波长范围内扫描。1.2.5.2标准曲线的制作取上述母液分别吸取不同浓度梯度在紫外分光光度计328nm下检测吸光度绘制标准曲线。1.2.5.3稳定性实验吸取母液5mL，置于50mL容量瓶中，然后用50%甲醇溶液稀释定容，在室温下静置存放，每隔4h测定一次，观察吸光度的变化情况，其试验结果。1.2.5.4牛蒡叶中绿原酸提取液的紫外扫描图称取一定量提取纯化后的绿原酸粗干粉用50%甲醇溶解，稀释后，以50%甲11 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立醇为参比液，作空白实验。采用紫外可见分光光度计在220-400nm的波长范围内扫描。1.2牛蒡叶中绿原酸的检测方法将牛蒡叶提取液，过滤后定容稀释，在328nm紫外可见分光光度计测吸光度值，代入标准曲线上，即可查出该样品对应的提取液中的绿原酸的浓度。1.3回收率实验精确称取一定量的牛蒡叶提取物，加无水乙醇到刻度，得到待测样品液。在紫外可见分光光度计328nm处测定吸光度值。另外，在待测溶液中加入一定量的绿原酸标准样品，并稀释一定的倍数后，以无水乙醇作空白，在328nm处测定吸光度值，计算回收率。1.2.1结果与分析1.2.4.1薄板层析展开剂的确定用玻璃点样毛细管分别将绿原酸标准品和牛蒡叶提取液点样，用氯仿：甲醇：水体系作为展开剂效果较差，绿原酸斑点不清楚、不集中；正丁醇：乙酸：水体系中正丁醇:乙酸:水=4:1:5（V/V）混合后上清液作为展开剂，在紫外分析仪365nm下蓝色斑点清晰、集中、无拖尾现象。因此采用正丁醇:乙酸:水=4:1:5（V/V）上清液作为展开剂效果最好。1.2.4.2UV最大吸收波长的确定采用浓度为0.0504mg/mL绿原酸标准液，以50%甲醇溶液作为参比液，用紫外可见分光光度计在220～400nm波长范围扫描，扫描结果为图2-1。从图可以看到标准液在328nm处有最大吸收峰，在225nm处有肩峰出现。考虑到紫外分光光度及检测系统在225nm附近的灵敏度不高，以及资料显示绿原酸的吸收峰在330nm左右，故选择328nm为最大吸收波长。12 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立图2-1绿原酸标准品紫外吸收光谱Fig.2-1Ultravioletabsorptionspectroscopyofstandardchlorogenicacid1.2标准曲线的制作采用浓度为0.0504mg/mL绿原酸标准液为母液，分别吸取1.0mL、2.0mL、3.0mL、1.2.1mL、5.0mL、6.0mL用50%甲醇定容于10mL，用紫外可见分光光度计在328nm波长处测量吸光度。以样品的浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到了相应的回归方程。其相应的标准曲线的回归方程为Y=49.711X+0.1306，R2=0.9998，标准曲线见图2-2。1.2.4.11.2.5.1y=49.711x+0.1306R2=0.99982=0.99981.20.90.60.3000.010.020.030.04绿原酸浓度(mg/mL)图2-2绿原酸标准品吸光度标准曲线Fig.2-2Standardcurveoftheabsorptioncapacityofstandardchlorogenicacid1.3稳定性实验标准溶液的稳定性大小，是影响分析测定结果准确的重要因素，测定的最终溶液是50%甲醇溶液。根据图2-3显示可以看出绿原酸在24h内，其吸光度值变化不大。因此，用50%甲醇溶液做参比是合适的，表明绿原酸在50%甲醇溶液中在24h内稳定。13 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立1.21.2.11.2.4.101020304050放置时间（h）图2-3绿原酸在50%甲醇溶液的稳定性Fig.2-3Stabilityofchlorogenicacidin50%methanol1.2.5.1牛蒡叶中绿原酸提取液的紫外扫描图从扫描图谱2-4可以看出提取液图谱与对照品图谱走向一样，且都在328nm附近有一最大吸收峰，说明牛蒡叶提取物中含有绿原酸成分。图2-4提取液样品紫外吸收光谱Fig.2-4Ultravioletabsorptionspectroscopyofthesample1.2.5.2回收率的测定由标准曲线计算出待测样品液浓度，根据公式可以计算出样品中绿原酸的含量，计算回收率，样品的回收率结果见表2-1，从表可以看出：本方法的回收率为100.2%，相对标准偏差为0.82%。表明用紫外可见分光光度法测定牛蒡叶中的绿原酸含量，相对标准偏差较小，测定结果重现性好，精密度高，所得数据准确。14 第二章牛蒡叶中绿原酸分析方法的建立表2-1加样回收率测定结果Table2-1Thedeterminationresultoftheratioofthesample序号样品中绿原酸含量(mg)标准品加入量(mg)测定量(mg)回收率(%)10.4750.150.62299.5%20.4750.200.678100.4%30.4750.250.733101.1%40.4750.300.76999.2%50.4750.350.832100.8%平均回收率X=100.2%RSD=0.82%1.2结论建立了实验室定性定量测定牛蒡叶中绿原酸的方法。采用薄板层析-紫外分光光度法能够快速的进行定性鉴定牛蒡叶中是否含有绿原酸，方法简便快速，节约成本。确定牛蒡叶中绿原酸的最大吸收波长为328nm，应用薄板层析法来定性检测绿原酸的存在，找到了较为理想的展开剂正丁醇:乙酸:水=4:1:5(V/V)上清液，使得粗提物中各种杂质有效的分开，而且绿原酸的Rf值较为适合。用该法测定牛蒡叶中的绿原酸的含量，相对标准偏差较小，测定结果重现性好，精密度较高，所得数据准确可靠。15 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺优化绿原酸(chlorogenicacid)为咖啡酰奎尼酸衍生物，是植物在有氧呼吸过程中产生的一种苯丙素类化合物，抗氧化能力强，还具有抗艾滋病毒、抗肿瘤细胞、抗致畸、抗过敏及抗氧化、清除自由基等功能[63]，是许多中药及茶叶质量控制的指标。绿原酸类化合物是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水、醇、丙酮等溶剂。牛蒡叶中生物活性成分绿原酸是否能被有效利用，提取、纯化和精制的效果是关键。常见天然产物的分离提取方法有溶剂浸提、过滤、沉淀，绿原酸的提取方法主要有水提法、有机溶剂提取法、水提醇沉法、醇提铅沉法和石灰乳沉淀法，再利用纸层析、柱层析、萃取、高效液相等方法对进行纯化。水溶液提取的优点是经济、安全、实用，不足之处是增加了其它水溶性成份如蛋白质、多糖和鞣质等的含量，使过滤、纯化等后续工艺的难度加大。有机溶剂如乙醇溶液提取，杂质含量低、提取效率高、且乙醇可以回收利用，利于后续的纯化工作，但工业上提取要防爆等安全设施，对设备要求相对较高。因此，一些新技术逐渐被应用到中药有效成分的提取研究中来，现已在中药分析的研究中广泛应用的微波提取法就是一种运用微波技术来辅助提取的方法，近年发展较为迅速[64]。微波萃取能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，具有较好的选择性，另一方面微波加热利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热，因此热效率高、升温快速均匀，大大缩短了萃取时间，提高了效率。近年来在中草药的有效成份提取中应用逐渐增多。通过微波水提取银杏叶黄酮苷类物质与传统单纯水煮[65]，微波处理后乙醇水溶液提取与传统只用乙醇水溶液提取效果进行对照，发现溶剂萃取前对银杏叶、水混合物进行短时间微波处理后能大大提高银杏黄酮提取率，缩短溶剂萃取所需时间。采用微波细胞破碎法对高山红景天愈伤组织中有效活性成分的提取[66]与传统工艺比较，微波破碎法提取具有提取时间短，不需加热，提取液中的杂质少等优点。因而可以认为，利用微波对细胞的穿透性和破碎性[67-68]尤其是对提取成份的选择性，结合传统溶剂萃取法用于牛蒡叶中的绿原酸提取，会取得良好的效果。目前，植物提取工艺多采取紫外分光光度法来定量含量。该方法的优点在于简便易行，不足之处是测定结果偏高，为该波段所有具光吸收物质吸光度的总和，不能精16 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化确地估计含量。但若提取溶剂相同，可以作为参考。本研究在于选择最优的工艺，因此可采用紫外分光光度法定量。本章应用乙醇提取法和微波-乙醇提取法对牛蒡叶中的绿原酸进行了提取，以紫外分光光度计为检测手段，确定了这两种方法的最佳工艺条件，为工业上生产提供理论指导和参考数据；并将这两种方法进行了比较，为其在食品、保健、医疗等行业的提取应用打下基础。1.2材料与方法1.2.1实验材料和试剂牛蒡叶(购自徐州)，新鲜牛蒡叶于室内室温(约25℃)自然晾干或50℃烘干,磨碎备用；绿原酸标准品，中国药品生物制品鉴定所；乙醇为95%食用纯，南京久亿化学试剂有限公司。1.2.2实验仪器UV1102紫外/可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司AE260电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司FW型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司LD4-2离心机北京医用离心机厂KQ5200E超声波波清洗器昆山市超声仪器有限公司pH计电导率离子综合测试仪梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司WD700G/WD800G格兰仕型微波炉佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司1.3乙醇提取法1.2.4.1实验方法1.2.5.1牛蒡叶绿原酸得率的测定准确称取牛蒡叶干粉10g于圆底烧瓶中，加入80%浓度的乙醇溶液200mL，在80℃条件下乙醇回流提取3次，提取液经离心过滤，滤液50℃浓缩后，石油醚脱色，17 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化脱色后再浓缩为膏状称重。将膏状物溶于50%甲醇溶液定容于50mL容量瓶作待测液。吸取待测液1mL定容于50mL容量瓶中在328nm波长下测定吸光度A，根据下列公式计算牛蒡叶中绿原酸的得率。牛蒡叶中绿原酸含量(%)=A0.1306−×稀释倍数1.2100×牛蒡叶干粉质量(mg)制备液中绿原酸质量(mg) 得率(%)100 牛蒡叶干粉质量(mg)=×1.2.1单因素试验及响应曲面试验方法设计本研究通过对乙醇提取法工艺中乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间等影响牛蒡叶中绿原酸提取得率的因素进行单因素试验及响应曲面试验，确定最佳的工艺参数。1)单因素试验最佳乙醇浓度的选择在提取温度50℃，提取时间2h，料液比1:15，提取1次的条件下，比较不同乙醇浓度对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。最佳提取温度的选择在提取时间2h，乙醇浓度30%，料液比1:15，提取1次的条件下，比较不同提取温度对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。最佳料液比的选择在提取温度70℃，提取时间2h，乙醇浓度为30%，提取1次条件下比较不同料液比对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。最佳提取时间的选择在提取温度70℃，乙醇浓度30%，料液比1:20，提取1次的条件下，比较不同提取时间对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。最佳PH值的选择在提取温度70℃，乙醇浓度30%，料液比1:20，提取时间2h，提取1次的条件下，比较不同pH值对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。最佳提取次数的选择在提取温度70℃，乙醇浓度30%，料液比1:20，提取时间2h，pH=4，提取1次的条件下，比较不同提取次数对牛蒡叶中绿原酸提取效果的影响。2)响应曲面试验设计本文采用响应曲面法(ResponseSurfaceAnalysis)中心复合设计，以提取溶剂乙醇浓度、提取温度、料液比(重量体积比g/mL)为自变量，以牛蒡叶绿原酸得率为指标设计了3因素3水平共计17个实验点的实验方案，因子编码及水平设计见表3-1。 18 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化对乙醇浓度A、提取温度B及料液比C作如下变换：X1=(A-30)/10，X2=(B-70)/10，X3=(C-20)/5。以X1、X2、X3为自变量，以绿原酸提取率为响应值(Y)，试验方案及结果见表3-2。表3-1响应曲面因素和水平Table3-1AnalyticalfactorsandlevelsforRSA因素水平-101A乙醇浓度(%)203040B温度(℃)607080C料液比(g/mL)1:151:201:251.2结果与分析1.2.1单因素试验结果与分析1)最佳乙醇浓度的选择结果1.2.4.11.2.5.11.20.90.60.3102030405060708090乙醇浓度(%)图3-1乙醇浓度对得率的影响Fig.3-1Effectsofconcentrationofethanolonextractingrate由图3-1可知随着乙醇浓度的增加，绿原酸的得率逐渐升高，乙醇浓度达到30%时，得率最高。随后乙醇浓度继续升高绿原酸得率反而下降，当乙醇浓度大于30%时绿原酸得率迅速下降。绿原酸的极性易溶于低浓度的乙醇，另外高醇可能造成牛蒡叶中叶绿素等其他物质的溶出对绿原酸产生干扰，于是高醇中绿原酸得率下降。19 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化2)料液比对提取效果的影响0.641.2.11.2.4.11.2.5.11.20.90.61:101:151:201:251:301:35料液比(g/mL)图3-2料液比对得率的影响Fig.3-2Effectsofratioofmaterialtosolventonextractingrate一般料液比越大，绿原酸的得率越大。由图3-2可见料液比在1:30与1:35之间变化不大，分析其原因，在一定范围内溶剂用量增加有助于牛蒡叶绿原酸的浸出，溶剂用量少，提取不太完全，但溶剂用量过大，水浴加热的负荷增大，达到提取完全所需要的时间也增长，使得在有限的时间内提取不完全。因此牛蒡叶中绿原酸的提取溶剂不超过1:25最好。3)提取时间对提取效果的影响0.30.60.550.50.450.4306090120150180210提取时间(min)图3-3提取时间对得率的影响Fig.3-3Effectsofextractingtimeonextractingrate提取时间是工艺研究的一个重要因素，它决定生产成本和消耗。由图3-3可看出随着提取时间的延长，绿原酸的得率不断增加从30min到120min，绿原酸得率提高幅度较大，继续增加提取时间绿原酸得率涨幅不大，甚至有下降趋势可能与绿原酸长时间放置造成损失有关，也表明长时间回流易于导致乙醇溶液的挥发，从而影响提取效果。因此，绿原酸提取在2小时可达到满意效果。20 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化4)提取温度对提取效果的影响0.71.2.11.2.4.11.2.5.11.20.90.60.30.62030405060708090100温度(oC)图3-4温度对得率的影响Fig.3-4Effectsoftemperatureonextractingrate由图3-4可知，随着温度的升高，溶剂的黏度减小，分子运动速度加快，浸提液的扩散系数增加，使浸提速度加快。绿原酸的得率随着温度升高而增加，当温度到达70℃使得率为最大，温度继续升高得率呈下降趋势，这可能是绿原酸的邻苯二酚结构不稳定，高温下易氧化分解[69]，且杂质的溶出量也会增加导致温度过高提取液中绿原酸得率下降。因此，温度不超过70℃。5）提取液pH值对得率的影响0.550.50.450.40.40.30.22345678pH图3-5溶剂pH值对绿原酸提取得率的影响Fig.3-5EffectsofpHonflavonesextractingrate由上图可知，当pH为4.0时提取率最高，当pH值大于4.0时，绿原酸的提取率下降。随着溶剂的碱性增强，叶绿素或其它杂质被溶解，而达到饱和，故总绿原酸不能充分溶出，导致提取率下降。另一方面，强碱性溶剂在高温时容易使绿原酸类化合物的母核被破坏，从而导致提取率下降。绿原酸是极性有机酸，在酸性介质中比较稳定，因此绿原酸提取宜在酸性溶液中进行。选择最佳提取pH为4.0。21 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化6）提取次数的确定称取牛蒡叶中干粉适量，采用30%乙醇浓度，料液比为1:20，提取温度为70℃，2小时进行3次提取，各次的提取得率见表3-2。表3-2提取次数对提取得率的影响Table3-2Effectsofextractiontimesontheextractingrate提取次数提取得率（%）10.5220.1130.05总量0.68随着提取次数增加，其它杂质的溶出量也会有所增加，增加溶剂的回收也是不经济的。由表3-2可以看出，从第二次开始提取得率下降迅速，很有可能跟牛蒡叶溶质容易溶出有关。考虑到实际生产的经济性，故而最终确定提取次数为1次。1.2响应曲面分析结果对乙醇浓度A、提取温度B及料液比C作如下变换：X1=(A-30)/10，X2=(B-70)/10，X3=(C-20)/5。以X1、X2、X3为自变量，以绿原酸提取率为响应值(Y)，试验方案及结果见表3-3。以牛蒡叶绿原酸的提取率为响应值，利用DesignExpert软件对表3-3数据进行回归分析，得二次多元回归模型：Y=0.6954+0.004625X1+0.07737X2+0.04525X3-0.11382X12-0.055325X22-0.011575X32-0.00975X1X2+0.0095X1X3-0.006X2X3对该模型进行回归分析，结果见表3-4。22 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化表3-3响应面分析方案及试验结果Table3-3ProgramandtestresultsofRSA实验号X1X2X3Y得率(%)110-10.51720000.69831010.63840000.69351-100.44260000.69570110.7218-1-100.41990000.69510-1100.630110000.696120-110.615131100.614140-1-10.52415-10-10.5211601-10.65417-1010.604表3-4回归分析结果Table3-4Resultsofregressionanalysis方差来源自由度平方和均方F值Pr＞F显著性X110.0001710.0001710.393397260.5504X210.0478950.047895110.105544<0.0001***X310.0163810.01638137.65694020.0005**X1X210.000380.000380.874152280.3809X1X310.0003610.0003610.829898680.3926X2X310.0001440.0001440.331039920.5831X1X110.0545520.054552125.409252<0.0001***X2X210.0128880.01288829.62764320.0010**X3X310.0005640.0005641.296869450.2923模型90.1376210.01529135.1527949<0.0001***残差70.0030450.000435总和160.140666注：**显著水平＜0.01，***显著水平＜0.001由表3-4可知，上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(r=97.84%)，方程F＞F0.01(9,4)=14.66,所以该方程是极23 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化显著的。若p＜0.05方程是显著的，则表3-4中X2、X3、X1X1和X2X2项的影响是显著的；模型的调整确定系数R2=0.9984,说明该模型能解释99.84%响应值的变化来源于所选变量，即乙醇浓度、提取温度和料液比,因而该模型拟合程度比较好,试验误差小。因此，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。回归方程的各项方差分析结果表明，一次项和二次项都有显著性因素，因此各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。所以，可以利用该回归方程确定绿原酸最佳提取工艺条件。根据回归方程作出不同因子的响应面分析图，结果见图3-6，3-7，3-8。图3-6乙醇浓度、温度对得率的影响图3-7乙醇浓度、料液比对得率的影响Fig.3-6ResponsesurfacesofY=f(X1,X2)Fig.3-7ResponsesurfacesofY=f(X1,X3)图3-8温度、料液比对得率的影响Fig.3-8ResponsesurfacesofY=f(X2,X3)24 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化从响应曲面分析图上形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特征值均为正值时，响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在；当特征值为负值时，为山丘曲面，有极大值存在；当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在[70]。因此从图3-6，3-7与3-8可以看出，得率Y随着任意两个编码值的增加呈先升高后降低的趋势，说明各交互因子均有一个最佳编码组合使得率Y达到最高。为了进一步确证最佳点的取值,对回归方程取一阶偏导等于零数并整理得：0.4625-0.22764X1-0.00975X2+0.0095X3=01.2.1-0.00975X1-0.11065X2-0.006X3=01.2.4.1+0.0095X1-0.006X2-0.02314X3=0解得X1=0.071、X2=0.594、X3=1.830。代入变换公式即得乙醇浓度为31%，温度为76℃，料液比为1:29。即在76℃下乙醇浓度为31%，料液比为1:29时由回归方程预测在此条件下绿原酸得率的理论值为0.834%。1.2.5.1验正试验按上面优选工艺平行提取3次，绿原酸平均得率为0.826%，与理论值偏差小于1%表明试验所确定的工艺为优选工艺。1.2结论响应曲面法可以从给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而找到整个区域内因素的最佳组合和响应值的最优值。响应曲面法以其试验次数少、周期短,求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的诸多优点,在很大程度上满足了这些要求[71]。本研究即采用响应曲面法分析方法对牛蒡叶中绿原酸的提取工艺参数进行了初步的探讨,得出了最佳优化的工艺条件:对牛蒡叶中绿原酸提取的工艺条件中乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间的最优化组合问题进行了定量研究,建立了具有良好预测性能的牛蒡叶中绿原酸取条件的模型；利用回归模型对工艺条件的最优化组合,对各单因子要素的绿原酸提取率及其交互作用进行了探讨,得出各因素之间交互作用的情况；通过工艺条件的优化得出的最佳工艺条件为：乙醇浓度为31%，温度为76℃，料液比为1:29时牛蒡叶中绿原酸得率处于最高水平。25 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化1.2微波-乙醇提取法1.2.1实验方法1.2.4.1绿原酸的提取工艺称取一定质量的牛蒡叶干粉置于具塞三角瓶中加入适量乙醇提取液，在加溶剂时一定要把粘附在三角瓶内壁上的样品冲洗到杯内，并确保溶剂完全淹没样品。然后盖上塞子静置15min，使溶剂充分浸透牛蒡叶。将具塞三角瓶盖上盖子放入微波炉中，设定微波时间和功率进行提取。合并提取液过滤离心，滤液为待测液，于328nm波长在紫外分光光度计测其吸光度并计算绿原酸得率。1.2.4.2单因素试验按上述方法对牛蒡叶中绿原酸进行提取，分别考察微波处理过程中提取溶剂乙醇浓度、微波功率、提取时间和料液比等因素对提取率的影响。1.2.4.3正交优化试验设计在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、微波功率、提取时间和料液比为考察因素，以测得的绿原酸提取率为考察指标，设计正交试验因素水平表，进行L9(34)正交试验，优化微波乙醇提取的最佳条件。表3-5微波提取的正交试验表Table3-5Thefactor-leveltableoforthogonaldesign因素水平ABCD乙醇浓度（%）微波功率（W）提取时间（S）料液比（g/mL）130320901:152404801501:203506402101:251.2.2结果与分析1.2.5.1单因素试验结果与分析26 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化1）乙醇浓度对提取得率的影响0.61.2.11.2.4.11.2.5.11.20.90.60.320304050607080乙醇浓度（%）图3-9乙醇浓度对提取得率的影响Fig.3-9Effectsofconcentrationofethanolonextractingrate提取天然植物中绿原酸常用的溶剂有水和乙醇溶液。有文献[72]比较了不同溶剂下牛蒡叶中绿原酸提取率，发现乙醇水溶液提取效果优于水提。因此，本试验选用乙醇水溶液作提取剂，在微波功率640W、提取时间2min和料液比1:15的条件下，考察提取剂中乙醇体积分数对提取率的影响，结果如图3-9所示。结果表明，随着乙醇体积分数的提高，绿原酸的提取率先是不断增加，直到40%时达最高；然后，当乙醇体积分数高于40%时，所得提取率不断降低。2)微波功率对提取得率的影响0.60.550.50.450.40.4160320480640800功率(W)图3-10微波功率对提取得率的影响Fig.3-10Effectsofmicrowavepoweronextractingrate功率太小，不能让渗透到叶组织的乙醇完全汽化，过高又容易产生焦化，该因数和微波预处理时间存在相互作用[74]。在固定乙醇浓度为40%、料液比1:20和提取时间210S的条件下，微波功率对得率的影响如图3-10所示。图3-10显示，随着微波功率的提高，绿原酸的提取率先是增加，当高于480W以后，提取率反而不断降低。这是由27 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化于微波作用速度快、易造成局部过热现象。当微波功率过大时，因局部过热易使绿原酸氧化或分解。从在功率480W下的提取液为淡绿色和在800W下的提取液为棕色这颜色变化也能得到证实。3)微波提取时间对提取得率的影响0.551.2.11.2.4.11.2.5.11.20.93090150210270330390时间(s)图3-11提取时间对提取得率的影响Fig.3-11Effectsofextractingtimeonextractingrate在微波功率640W、乙醇浓度40%和料液比1:20的条件下，微波提取时间对提取得率的影响如图3-11所示。图3-11显示，随着提取时间的增加，绿原酸的得率先是显著提高，至210S时提取率最高，然后随着提取时间继续增加，提取率没有明显变化，甚至得率下降。表明:提取时间过长可能使绿原酸分解，这是由于实验过程不能控制温度，所以因提取时间增加使体系温度升高，而导致绿原酸提取物分解和提取率降低[73]。因此提取时间不超过210S为宜。2）料液比对提取得率的影响0.60.30.60.550.51:101:151:201:251:30料液比(g/mL)图3-12料液比对提取得率的影响Fig.3-12Effectsofratioofmaterialtosolventonextractingrate料液比是影响提取的一个重要因素。主要表现在影响固相主体和液相主体之间的28 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化浓度差，即传质推动力上。在微波功率640W、提取时间2min和乙醇体积分数40%的条件下，乙醇溶液用量对提取率的影响如图3-12所示。表明：在一定范围内，随着料液比的增加，得率提高；在料液比为1:20处达到最大；当料液比继续增加时，得率反而下降。随着提取剂用量的增加，提高了提取过程的传质推动动力，绿原酸的得率先是迅速提高，但当提取剂用量>20mL即为样品质量的20倍以后使溶剂升高到相同的温度所需要的时间亦变长，即在相同的微波加热时间内，溶剂量大的体系温度较低，将影响溶质在溶剂中的扩散。1.2正交试验结果牛蒡叶中绿原酸提取正交试验结果及其各因素与绿原酸提取效果的影响关系，见表3-6。表3-6正交试验结果与分析Table3-6OrthogonalexperimentandanalysisoftheresultABCD试验号乙醇浓度微波功率提取时间料液比得率（%）(%)(W)(S)（g/mL）111110.46212220.68313330.51421230.72522310.80623120.57731320.6089332312311.2.11.2.4.1K11.2.5.10.5930.5730.607K21.20.7230.6530.617K30.90.5470.6370.6400.6(x)R0.1470.1760.0800.033表3-7方差分析表Table3-7Varianceanalysis因素偏差平方和自由度F比乙醇浓度(A)0.032216.0微波功率(B)0.050229.0提取时间(C)0.01125.5料液比(D)0.321.0注：F0.05(2.2)=19.00F0.01(2,2)=99.0029 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化由极差分析结果得出，影响绿原酸提取效率的因素主次顺序为B>A>C>D，即微波功率对试验结果影响最大，乙醇浓度、提取时间分别次之，料液比影响最小。提取工艺条件为A2B2C2D3。因为最佳组合不在试验组合内，做验证试验可得：微波-乙醇法提取牛蒡叶中绿原酸的最佳组合为A2B2C2D3，即乙醇溶剂浓度为40%，微波功率为480W，提取时间为150S，液料比为1:25时绿原酸得率为0.81%。1.2讨论1.2.1最佳条件确定乙醇提取法：通过工艺条件的优化得出的最佳工艺条件为：乙醇浓度为31%，温度为76℃，料液比为1:29时牛蒡叶中绿原酸得率处于最高水平。微波-乙醇提取法：乙醇溶剂浓度为40%，微波功率为480W，提取时间为150S，料液比为1:25时牛蒡叶中绿原酸得率处于最高水平。1.2.2两种方法比较有效成分的提取是天然产物分离的第一步，对其以后的分离有很大的影响。本章系统研究和探讨了乙醇溶液提取和微波-乙醇溶液提取绿原酸的两种方法，并进行了比较，结果见表3-8。乙醇提取法的得率略高于微波-乙醇溶液提取法。乙醇溶液提取设备和工艺简单，但需消耗大量的有机溶剂，提取时间较长、成本高。微波-乙醇溶液提取法溶剂用量较少提取时间短、成本低，为后续工艺加快进程，比较适合绿原酸的粗提取，但是微波提取时温度无法确定，没有温度测量装置，有可能使温度过高不利于绿原酸的稳定，导致提取率不高。总的来讲采用微波-乙醇法提取牛蒡叶中总绿原酸省时、节能、经济，是牛蒡叶中提取绿原酸的有效途径。表3-8乙醇提取法与微波-乙醇法结果的比较Table3-8Theresultscomparisonofethanolextractionandmicrowave-ethanolextraction方法乙醇浓度(%)料液比(g/mL)提取时间(min)得率(%)乙醇提取法311:291200.826微波醇提法401:252.50.8130 第三章牛蒡叶中绿原酸提取工艺的优化1.2存在问题由于两种提取优化方法存在不同，也导致结果上可能有所偏差；但是单从最优工艺优化方面看微波提取方法可使植物组织进入溶剂的传质过程明显节约时间、溶剂和能耗，是一种适合于牛蒡叶中绿原酸快速提取的新方法。31 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究传统的绿原酸提取工艺多采用溶剂萃取法，提取法工艺简单、成本低、不会对环境造成污染，但溶出的牛蒡叶提取物中除含有绿原酸外，还含有大量的鞣质、叶绿素、蛋白质与糖类等物质，为解决提取物颜色深、易于吸潮、杂质多等问题，提高绿原酸的含量，必须对提取液进一步分离纯化。目前大孔吸附树脂已广泛地应用在食品、化工、环保、医药工业和临床鉴定等领域，进行植物化学成分的分离纯化；利用大孔吸附树脂进行分离和纯化植物中有效成分及其它天然产物的研究已越来越受到人们的重视。提取液经浓缩回收乙醇后，绿原酸主要存在于浓缩液中。同时，绿原酸的理化性质使其易于大孔吸附树脂吸附[75]，完全符合利用大孔吸附树脂柱层析法分离化合物的条件。大孔吸附树脂(macroporousadsorptionresin)是一类人工合成的、具有多孔网状结构和表面活性的高分子材料。它一般不带功能基或带有某种极性基团，介于离子交换树脂和活性炭之间，是一种新型的有机高聚物吸附剂。由于其内部具有许多适当大小的孔穴，吸附性能很好，所以它又被称为聚合物吸附剂(polymeradsorbents)。同其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好，易于解吸附、机械强度高、再生处理简便、吸附迅速等优点，尤其适合于从水溶液中分离低极性或非极性的化合物[76-77]。利用其吸附性和选择性相结合的原理，可将其用于分离提取药物、处理工业废水、气体净化等，它还可作为药物、农药、催化剂和酶的载体，以及胶渗透色谱分离高聚物等等。大孔树脂吸附法仅用少量的溶剂洗脱树脂就能达到分离目的，溶剂用量大大减少，避免了溶媒法出现的严重乳化现象，与溶媒法和沉淀法相比，大孔树脂法具有独到的优越性[78]。本章探讨了首先把牛蒡叶提取液进行过滤离心处理，选择四种国产大孔吸附树脂，较系统地对CGA的吸附量、解吸率进行研究，为CGA的分离选择适宜的大孔吸附树脂及对其影响分离因素进行研究，为生产工艺的设计和工业化生产提供基本的工艺参数。32 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究1.2实验仪器与材料1.2.1实验仪器UV1102紫外/可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司AE260型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司精密pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司恒流泵HL-3上海沪西分析仪器厂自动部分收集器上海沪西分析仪器厂玻璃层析柱(3cm×60cm)南京三爱玻璃仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂1.2.2实验材料与试剂牛蒡叶购自徐州；乙醇为分析纯南京久亿化学试剂有限公司；大孔树脂镇江九天化工有限公司，吸附树脂的基本物理性质如表4-1所示：表4-1实验所用吸附树脂的基本性质Table4-lBasicpropertiesofmacroporousresinintheexperiment型号极性粒径比表面积平均孔径空隙率孔容polarityPearlSurfaceAve.PoreDiamPorosityPoreVolumeSize(mm)Area(m2/g)2/g)Angstroms(nm)(%)(mL/g)Jt003medium0.3-1.25100-20029.0-30.050-601.2-1.24Jt008weak0.3-1.25480-52013.0-14.042-460.73-0.77Jt012weak0.3-1.25450-55028.0-29.042-460.73-0.77Jt021non0.3-1.25250-29015.5-16.542-460.73-0.771.3实验内容与方法1.2.4.1大孔吸附树脂的预处理和再生大孔树脂在装柱之前，要进行预处理以便除去微量的防腐剂和残留的单体化合33 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究物。具体的做法是，在吸附柱内加入相当于填充树脂体积的0.4-0.5倍的乙醇，然后将新的树脂各自投入吸附柱中。使其液面稍高于树脂，浸泡24h，充分溶胀。然后用2BV/h（树脂床体积，Bedvolume，BV）乙醇淋洗树脂，至流出液加入少量蒸馏水后不呈现白色浑浊为止。并用蒸馏水以同样的流速洗净乙醇。再用2BV的5%HCl溶液，以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4h，再用蒸馏水以同样流速洗至pH呈中性。然后用2BV的5%NaOH溶液，以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4h，再用蒸馏水以同样流速洗至pH呈中性。留一部分树脂保存在柱子中备用，另取一部分过滤，室温晾干备用。树脂再生可用含量为95%的乙醇洗脱树脂柱至流出液为无色；经多次使用后树脂吸附的杂质较多，颜色变深，可自柱上端加入5%NaOH水溶液和5%HCI水溶液洗脱，最后用水洗至下口流出液为中性即可再用。1.2吸附树脂的装柱采用常规湿法装柱，装柱前于柱内倒入一定量的水。将带水的吸附树脂，沿着玻璃棒一次性加入层析柱中，同时开启柱底活塞，水从底部缓缓流出，使树脂自然沉降而不留气泡，注意在装柱过程中始终保持液面高出树脂层面20cm以上。1.3样品预处理称取适量牛蒡叶干粉，用40%乙醇溶液提取，料液比为1:20，在70℃提取2次每次两小时。合并提取液过滤，浓缩滤液至无醇味后，用适量去离子水溶解配成不同浓度的绿原酸溶液，再用微孔滤膜抽滤，除去浓缩液中的悬浮物及大分子化合物，以免污染树脂。1.4大孔树脂吸附容量的测定准确称取经预处理的干树脂各2g,置于25mL具塞磨口三角瓶中，精确加入CGA粗品溶液10mL，置于全温振荡(25℃,100次/分钟)培养箱中振荡24h。充分吸附后，过滤，测定滤液中CGA的浓度，按下列公式计算对CGA吸附量和吸附率。Q−(CC)V−×CC=0eE=0×eWC0100% 34 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究Q—重量吸附量（mg/g）E—吸附率C—粗绿原酸溶液的起始浓度（mg/mL）V—吸附液的体积（mL）0C—吸附平衡后溶液中绿原酸的浓度（mg/mL）W—干树脂重量（g）e1.2大孔树脂吸附解吸率的测定分别称取处理好干树脂2g装入锥形瓶中，加入提取的牛蒡叶溶液10mL，静态吸附12h后，将吸附平衡后的树脂分别装入内径1cm玻璃层吸柱中，加入95%乙醇30mL解吸液，以解吸，收集解吸液并定容于50mL95%乙醇中，测定解吸液中绿原酸浓度，计算解吸率：解吸量解吸率（%）100=×树脂吸附绿原酸总量1.3绿原酸吸附条件的确定根据吸附容量及解吸率的测定结果，选择Jt012树脂进行吸附条件的测定。首先将牛蒡叶中提取的绿原酸粗品配成一定浓度含量，加入装有已经预处理过的Jt012树脂的玻璃层析柱中，在一定条件下测定流出液中绿原酸的含量或者绿原酸的吸附率（吸附容量），选择最佳吸附条件。1.4解吸实验将Jt012吸附树脂浸泡在CGA的粗品溶液中，使树脂充分吸附平衡，将已吸附平衡的树脂装入层析柱中，先用4BV,pH=4.0的蒸馏水以1BV/h流速淋洗，然后分别采用20%,40%，60%和80%浓度的乙醇以1BV/h流速进行解吸，实验时连续不断地注入乙醇解析液，分段收集柱中流出液，用紫外分光光度计检测CGA的含量，合并相同成分的流出液并计算各自的解吸率。35 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究1.2结果与分析1.2.1四种树脂对绿原酸吸附与解吸效果比较本实验选用四种型号不同的大孔树脂对CGA粗品溶液进行分离纯化，考察它们对CGA吸附和解吸性能。1)吸附结果分析表4-2列出了CGA粗品溶液经Jt003,Jt008,Jt012和Jt021四种大孔吸附树脂吸附饱和后的吸附率。由表中的结果可看出，Jt003树脂对CGA的吸附能力较强可达到84%，其次是Jt012的吸附率为80%，而Jt008吸附率为60%,Jt021吸附率仅为41%较弱。说明四种树脂对CGA具有一定的选择性，这是因为树脂对物质的吸附量与树脂本身的物理结构和被吸附物质的性质有关。一般大孔吸附树脂与被吸附物质之间以范德华力作用(包括偶极间作用力、色散力、氢键等)。绿原酸是一个极性分子，极性强的树脂对它的作用力强，吸附性能比非极性树脂要好。树脂的比表面积也是影响树脂吸附量的重要因素，比表面积越大，对被吸附物质的吸附力越大，吸附量越大。Jt012树脂比表面积要比Jt008大，因而吸附率比Jt008高。表4-2四种树脂的吸附率Table4-2Adsorptionquantitiesof4macroporousresins树脂型号吸附液起始浓度平衡浓度吸附率(%)Resin（mg/mL）（mg/mL）adsorptionquantityJt0032.960.4784Jt0082.961.1860Jt0122.960.5980Jt0212.961.75412)解吸结果分析Jt012对CGA的解析率在65%，Jt012对CGA的解析率最大；其次是Jt003和Jt008均不到40%；Jt021对CGA的解析率最小。从表4-3中还可看出，Jt003树脂尽管对CGA的吸附量较高，但它对CGA解吸率很小，所以Jt003树脂都不适于CGA的制备性分离。36 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究表4-3四种树脂的解吸率Table4-3Desorptiverateof4macroporousresin树脂型号绿原酸吸附量解析液浓度解吸率(%)Resin（mg/g）（mg/mL）DesorptiverateJt00312.430.1939Jt0088.880.1132Jt01211.840.3165Jt0216.070.03113)吸附解吸结果综合分析吸附量、解析率和选择性是大孔吸附树脂在提取和分离产物时需要考虑的重要参数，它不仅要求吸附树脂具备较高的吸附量、吸附率，同时还应该具有较高的解析率和选择性。因此，根据上述实验结果分析，从吸附量和解吸率综合考虑，在分离CGA过程中，Jt012是一种较为理想的吸附树脂，因此选择Jt012树脂进行后续实验。1.2Jt012树脂吸附条件的选择1.2.1pH对吸附量的影响2015105012345678 pH图4-1pH值对Jt012大孔吸附树脂吸附量的影响Fig.4-1TheeffectionofpHonadsorptivequantityofCGAonmacroporousresinJt012本实验考察了不同pH值对Jt012大孔吸附树脂吸附量的影响，结果见图4-1。溶液的pH值对Jt012大孔吸附树脂对CGA吸附具有一定的影响。绿原酸是多羟基酚酸，具有弱酸性，在酸性条件下绿原酸以分子形式存在，疏水性增强，树脂对其吸附增强；37 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究但在强酸条件下，羟基酚类物质会形成佯盐，与树脂的吸附力减弱，不利于吸附。因此在pH2-4范围内，吸附量呈上升的趋势，当pH=4时吸附量最大；而当pH值>4时，CGA的稳定性开始下降，容易降解，不宜进行吸附。考虑到溶液pH值越高，绿原酸以离子形式存在，而且分子中的酯键易水解，稳定性越差。因此在本实验条件，选择溶液的pH值为4较为合适。1.2Jt012树脂对绿原酸的动态吸附曲线把浓度为0.296mg/mL，pH为4的提取液加入装有Jt012树脂的玻璃柱中，在流速为2BV/h，测定流出液中绿原酸的含量，绘制吸附曲线(如图4-2)。实验结果表明，当进样液体积为6-7BV时，流出液中的绿原酸含量逐渐升高，达到了树脂的饱和吸附，由此可见Jt012树脂可处理树脂体积5-6BV的提取液。1.2.11.2.4.11.2.5.11.20.90.60.30024681012上样体积（BV）图4-2Jt012树脂吸附曲线Fig.4-2TheabsorptioncurveofmacroporousresinsJt0121.3上样浓度对吸附量的影响(Jt012吸附树脂的等温吸附曲线)在室温下用一系列不同浓度的CGA溶液(pH值为4)来探讨CGA的浓度对Jt012树脂吸附率的影响。以吸附量对溶液平衡浓度作图，得到一条吸附等温曲线，见图4-3。38 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究8886848280780.10.20.30.40.50.6浓度（mg/mL)图4-3上样液浓度对吸附率影响Fig.4-3Therelationshipofabsorptionabilitywithconcentration大孔树脂的吸附率一般与进样浓度成反比，在低浓度下对吸附有利。实验表明上样浓度较低时，随着浓度的增加，吸附率增加，当上样浓度达到0.4mg/mL,达到该树脂的最佳吸附效果。随着上样液浓度的增加，树脂吸附率迅速降低。由于吸附树脂的吸附量不是很大，一般低浓度比较有利。如果原料浓度偏高则泄露较早，处理量小，树脂使用的周期短，树脂再生次数增加。由实验可知原料液的初始浓度以0.4mg/mL为宜。1.2.1Jt012树脂对绿原酸吸附动力学特性888684828078024681012时间（h）图4-4CGA的静态吸附动力曲线Fig.4-4ThestaticadsorptivedynamicurveofadsorbingCGA选用适于CGA制备性分离的Jt012树脂进行吸附动力学特性的研究实验，结果见图4-4。由静态吸附动力学曲线可见，在吸附的起始阶段(2-6h)，Jt012树脂对CGA的吸附率随着时间的增加而迅速增大；但在6h往后，树脂吸附率增加缓慢。经计算39 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究发现6h内CGA吸附量均可以达到平衡吸附量的86%以上，这说明Jt012树脂属于快速吸附类型的吸附树脂，因此，有利于提高生产效率，以满足工业生产的需要，就保证在较短的时间内树脂能够达到饱和吸附，树脂最佳吸附时间为6h。1.2进样液流速对吸附的影响将浓度为0.4mg/mL，pH为4的牛蒡叶提取液上柱，控制进样液的速度，考察不同进样液流速下树脂对绿原酸的吸附率的关系，结果如图4-5。可见流速越小，吸附效果越好，然而流速过小，吸附时间长，效率太低；吸附流速过大，使树脂的吸附率下降。综合考虑两方面的因素，在选用进样流速为2BV/h进行吸附。908580757065605512345流速（BV/h）图4-5进样液流速与吸附率的关系Fig.4-5Therelationshipofabsorptionabilitywithflowrateoftheadsorbate1.2.1Jt012树脂解吸条件的选择1.2.4.1解吸液乙醇浓度及体积对绿原酸分离的影响化合物经树脂吸附后，根据吸附力强弱不同而选用不同的洗脱剂。一般来说，吸附剂与吸附质以分子间色散力作用时，吸附力较弱，易于洗脱，而当吸附剂与吸附质以偶极间作用力或氢键作用时，吸附力强，不易于洗脱。本研究根据相似相溶原理，选用不同浓度的乙醇溶液洗脱。将Jt012吸附树脂浸泡在CGA的粗品溶液中，使树脂充分吸附平衡，然后以吸附平衡后的树脂装入层析柱中，先用3BV,pH=4的蒸馏水淋洗，再采用20%，40%，60%和80%的乙醇以3BV/h流速分别进行解吸附实验。解析液中CGA浓度和分离效果见表4-4。40 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究表4-4洗脱剂浓度与解吸率的关系Table4-4Therelationshipofadsorptionabilitywithconcentrationoftheelutingagent洗脱剂含乙醇浓度(%)解吸率(%)2041.44075.66078.18090.0从表4-4可以看出40%和60%乙醇浓度解析率都达到70%以上，绿原酸是缩酚酸在低浓度乙醇的溶解性更好，80%乙醇浓度解析率达到90%，但是乙醇浓度增加会使洗脱液中杂质含量太高，达不到有效分离的效果，而20%的乙醇水溶液对绿原酸的洗脱率不高。工业上应该节约成本，又取得好的解析率应该选用40%乙醇浓度作为解析液。1.2洗脱剂流速的确定按上述所确定的吸附条件进行动态吸附以后，以40%乙醇水溶液为洗脱剂，分别以1.0BV/h、2.0BV/h和3.0BV/h的流速进行洗脱。分别测定乙醇洗脱液中绿原酸的含量，计算解吸率，结果见表4-5。表4-5洗脱剂速度的考察结果Table4-5Theobservationoftheelegantspeed洗脱剂速度（BV/h）解吸率（%）1.2.189.41.2.4.187.11.2.5.178.2从表4-5可看出，洗脱剂流速为1.0BV/h时，解吸效果最好，但与洗脱剂流速为1.2BV/h时的情况悬殊不大。为提高效率，采用2.0BV/h的洗脱剂流速较好。1.3洗脱曲线的绘制41 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究在流速为2BV/h，用40%乙醇洗脱，其洗脱曲线如图4-6，可见用4倍树脂床体积的洗脱液基本上可将绿原酸洗脱下来，而且洗脱峰比较集中。0.351.2.11.2.4.11.2.5.11.20.90.600123456洗脱液体积（BV）图4-6Jt012树脂的洗脱曲线Fig.4-6Theabsorptioncurveofmacroporousresins0.3最佳吸附-解析条件的验证实验结果将处理好的树脂装入树脂柱中。用一定牛蒡叶提取物，配置浓度为0.4mg/mL上样液，调节pH=4，以流速为2BV/h上样，使其充分吸附饱和。然后以流速洗脱，用4BV树脂体积40%乙醇2BV/h洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，低温真空干燥，称重，测定纯度，见下表：表4-5最佳条件的验证实验Table4-5Theexperimentresultsofoptimumconditions实验上样提取物(g)粗品重量(g)收率(%)纯度(%)10.480.34271.3328.5320.480.34070.8526.7130.480.34672.1225.08平均0.480.34371.7326.740.6结论将大孔吸附树脂应用到牛蒡叶中绿原酸的分离，实验通过四种大孔吸附树脂对CGA吸附和解吸的研究，结果表明，弱极性的Jt012树脂不仅具有很大的吸附率，而且还具备较强的选择性，解吸容易，适于CGA的分离。同时还对影响Jt012树脂吸42 第四章大孔树脂分离牛蒡叶中绿原酸的研究附分离的各种因素(如进样液pH值、进样液浓度、吸附流速及洗脱条件)，得到最佳分离条件:采用pH=4，浓度为0.4mg/mL上样液，以2BV/h上样使其充分吸附；以4BV的40%的乙醇、2BV/h的流速解吸，可较好地分离CGA，含绿原酸26.74%的粗产品，收率为71.73%。43 第五章绿原酸的精制第五章绿原酸纯化技术研究绿原酸(chlorogenicacid)是一种多酚类化合物，易溶于极性溶剂(如水、乙醇)中，微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂中；绿原酸也是一种重要的生理活性物质，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用[79]。近年来,国内外采用先进的科学技术手段对绿原酸进行了研究,发现绿原酸是很有开发利用价值的,绿原酸开发利用也取得很大进展,从植物中提纯得到的绿原酸产品已广泛运用于食品、医药和日用化工等多个领域，应用前景非常广阔。绿原酸具有抗氧化、清除体内自由基和抗脂质过氧化、抗菌消炎等多种作用，目前已利用金银花、杜仲、银杏、穿心莲、绞股蓝、人参掌和丹参等植物资源开发出各种生物源性药物，对治疗动脉粥样硬化等疾病有显著疗效，它的主要有效成分就是绿原酸。很多抗菌消炎产品中，对于效果的好差直接用绿原酸作为质量控制的指标，绿原酸含量高，绿原酸纯度高，产品质量好。在废弃牛蒡叶中提取绿原酸，往往因为纯度不高，影响绿原酸的经济价值。牛蒡叶提取物中除含有绿原酸外，还含有大量的鞣质、蛋白质与糖类等物质，为解决提取物颜色深、易于吸潮、杂质多等问题，提高绿原酸的含量，必须对提取液进一步分离纯化。由于牛蒡叶资源丰富，从牛蒡叶中提取绿原酸价格低廉、无毒副作用,产品既可以为药品也可以为食品，开发前景非常广阔。柱层析分离技术是一种现代的物理化学分离手段，广泛应用于化学、化工、医药、生化、环保、农药等领域，是目前研究机构和教学实验室进行分离纯化不可缺少的重要方法之一。通过改变洗脱剂和提高柱效等手段，柱层析技术几乎可以将一切化合物分离开来，对植物中常常含有的结构及理化性质均很相似的系列化合物的分离提纯更具有无法比拟的优越性。因此，它是植物有效成分分离提纯的最佳方法。但通常的柱层析分离方法成本高，周期长，技术要求高，使其在规模化的工业生产中受到了严重限制。硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。44 第五章绿原酸的精制高效液相色谱法是70年代发展起来的一种色谱分析法，高效液相色谱法以其高速、高效、高灵敏度等优点在中药有效成分的检测中应用逐渐增多。为了达到最佳的分析效果，主要是色谱条件的选择，如色谱柱、流动相、流速等。一般分析方法，只能在不含干扰成分时做含量测定，很难用于分离测定，高效液相色谱是常用的定性定量分析手段，当检测成分中存在其他杂质的干扰时，高效液相色谱技术是绿原酸含量、分离测定的首选。由于绿原酸与其类似物质分子结构相似，常同时存在于同一药材或中药制剂，尤其是中药复方中，在进行含量测定时常难以分离。高效液相色谱法以其高速、高效、高灵敏度等优点，是国内外公认的准确测定植物有效成分的先进方法。本章为了建立一种更加迅速、简便分离方法，将考虑用硅胶层析法从大孔树脂分离出的样品中纯化绿原酸以及采用高效液相色谱法对牛蒡叶中绿原酸定量方法进行研究[80-81]。1.2实验材料与方法1.2.1实验材料与仪器绿原酸标准品（纯度98%）中国药品生物制品鉴定所薄层色谱硅胶预制板（10cm×20cm）烟台市化学工业研究所柱层层析硅胶（100-200目）青岛海洋化工厂分厂旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂高效液相色谱仪Agilengt1100氯仿甲醇均为分析纯南京久亿化学试剂有限公司绿原酸混合品：经大孔树脂纯化得到。1.2.2实验方法1.2.4.1硅胶柱层析制备称取一定量绿原酸混合品，用甲醇溶解后，加人适当100～200目的硅胶，用玻璃棒充分搅拌均匀，置于50℃水浴锅上加热，待溶剂挥发后，颗粒均匀而不腻手，冷却至室温，即成样品胶。硅胶装柱采用干法装柱：在底部塞有棉花的玻璃柱(3cm×60cm)45 第五章绿原酸的精制里装人100～200目的硅胶(即分离胶)，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装人干燥好的样品胶和棉花层。然后，加入更多的纯氯仿，用双联球加压打通硅胶柱，直至流速恒定。用V(氯仿):V(甲醇)为洗动相洗脱，并逐步调整洗脱相，用自动接收装置分别收集，用硅胶薄层层析板检测洗脱结果。1.2薄层层析法检测在一块硅胶薄层层析板上，用玻璃点样毛细管吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上，每次点样均需用电吹风吹干，然后置于盛有展开剂的层析缸中展开，待展开至规定距离(一般为4.5cm)后，取出吹干溶剂，移入紫外分析仪中观察，将样品中各种物质的Rf值与标准品的Rf值进行比较，检测绿原酸的存在。固定相：预制硅胶板（3mm×5mm）展开剂：正丁醇:乙酸:水=4:1:5（V/V）上清液显色：365nm紫外分析仪；碘蒸气展开方式：平行展开1.3高效液相色谱(HPLC)检测1)色谱条件色谱柱：symmetryC18(250mmX3.9mm)waters公司；紫外检测仪检测，检测波长为280nm；柱温30℃；进样量：5uL；流动相：40%甲醇+0.04%磷酸，均为色谱纯；流量为1mL/min。2)供液的配制标准溶液的配制：精密称取绿原酸标样15.6mg，用色谱甲醇溶解，用超声波超声10min，然后定容于25mL容量瓶中，浓度为0.624mg/mL,精密量取标准溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL分别置于10mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度。样品溶液的配制：精密称取硅胶纯化绿原酸17.5mg，用色谱甲醇溶解，用超声波超声10min，然后定容于25mL容量瓶中,浓度为0.7mg/mL,精密量取1.0mL置于10mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，测的峰面积。3)样品中绿原酸含量的测定根据上面中绿原酸制的标准曲线，用以下公式计算样品中绿原酸的含量：46 第五章绿原酸的精制（A）V+332.46××绿原酸（%）=100%93781MA-样品的绿原酸峰面积V-样品的体积mLM-样品绿原酸质量mg1.2绿原酸精制工艺路线图5-1制备高纯绿原酸的工艺方案Fig.5-1Processchartofhigh-puritychlorogenicacid1.2.1结果与分析1.2.4.1洗脱剂的选择称取待测绿原酸混合品3g，用10mL甲醇在60℃水浴中充分溶解后。加入100～200目的硅胶5g，搅拌均匀，继续在水浴中加热，直至溶剂挥发干燥后即成样品胶。然后在底部塞有棉花的玻璃柱中装入100～200目的分离胶90g，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶和棉花层。先用纯氯仿打通硅胶柱。然后先用V(氯仿):V(甲醇)=10:1为流动相洗脱，根据收集洗脱液在薄板层析展开效果，调整流动相。每次洗脱300mL，分别收集洗脱液，薄板层析检测。用V(氯仿):V(甲醇)=8:2洗脱液，蓝色斑点清晰、集中、无拖尾现象。47 第五章绿原酸的精制1.2薄板层析检测方法见第二章2.2.1，用V(氯仿):V(甲醇)=8:2洗脱液经过浓缩后进行点板，采用正丁醇:乙酸:水=4:1:5(V/V)上清液作为展开剂展开后吹干，在紫外分析仪365nm下蓝色斑点清晰、集中、无拖尾现象。1.3高效液相色谱法测定[82-85]1.2.1高效液相色谱色谱图从图5-3中可以看出，样品的色谱图中出现一个较大的单峰，其他峰面积较小，说明样品中纯度较高；和绿原酸标准色谱图5-2对照，绿原酸标准品的保留时间与样品的保留时间基本一致，峰形相同，说明为一种物质，但纯度没有标准样品高。图5-2绿原酸标样的高效液相色谱图Fig.5-2HPLCpattenofchlorogenicacidstandardsubstance图5-3绿原酸样品的高效液相色谱图Fig.5-3HPLCpattenofchlorogenicacidsample48 第五章绿原酸的精制1.2标准曲线绘制上述得到的单体成分，可以用高效液相色谱法作为纯度鉴定的有效方法。根据1.2.1中2)中标准溶液的配制，经0.45um微孔滤膜过滤，进样5uL，测得各组分的峰面积，结果见表5-1，以绿原酸浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线见图5-4。绿原酸浓度和吸收峰面积的回归方程为Y=93781X-332.46，其中相关系数R2=0.9994,线性范围在0.0312-0.1560mg/mL。表5-1不同浓度的绿原酸吸收面积Table5-1Adsorptionareaofchlorogenicacidindifferentconcentration取样量(mL)0.51.01.52.02.5浓度（mg/mL）0.03120.06240.09360.12480.156峰面积(mAU)2643.425472.968328.5111645.2014237.14160001400012000y=93781x-332.46R2=0.99942=0.9994100008000600040002000000.050.10.150.2 绿原酸浓度（mg/mL）图5-4HPLC分析绿原酸标准曲线Fig.5-4StandardcurveofchlorogenicacidafterHPLCanalysis1.2.4.1紫外光谱检测用紫外可见光度计在220-400nm的波长范围扫描结果见图5-5。从图中可以看出绿原酸样品液的最大吸收波长为328nm，与文献报道[22]一致。49 第五章绿原酸的精制图5-5提取液样品紫外吸收光谱Fig.5-5Ultravioletabsorptionspectroscopyofthesample1.2结论确立了牛蒡叶中绿原酸精制的方法。绿原酸混合品可以经硅胶柱纯化分离，用V(氯仿):V(甲醇)=8:2洗脱液，正丁醇:乙酸:水=4:1:5（V/V）上清液作为展开剂，较为合适，可以很好地进行分离。应用HPLC法来定量测定牛蒡叶中绿原酸的含量，采用色谱柱：symmetryC18(250mmX3.9mm)；紫外检测仪检测，流动相:40%甲醇+0.04%磷酸；出峰时间在8min左右。测得绿原酸混合品峰面积为4479.70，纯度在73.3%以上，为进一步作药理实验打下了基础。50 参考文献参考文献[1]石铸.中国植物志.第七十八卷.第一分册[M].北京:科学出版社,1987.[2]中华人民共和国商业部土产废品局,中国科学院植物研究所.中国经济植物志[M].北京:科学出版社,1961.[3]程肖蕊,李彦航.食药俱佳植物—牛蒡[J].中草药,1999(3):10.[4]蒋淑敏.牛蒡化学成分和药理作用的研究现状[J].时珍国医国药,2001,12(10):941-942.[5]江苏新医学院.中药大辞典:上册[M].上海:上海科学技术出版社,2001:102-106.[6]魏瑞兰.牛蒡活性成分研究进展[J].中国中医药信息杂志,1997,4(5):22.[7]孟楣,廖自荣,周建理.牛蒡根的生药学研究[J].基层中药杂志,2000,14(4):27-28.[8]胡喜兰,刘存瑞,曾宪佳,等.新疆不同地区牛蒡根中氨基酸和八种元素的含量分析[J].广西中医药，2002，25(2)：55-56.[9]牛蒡成分研究.中药大词典[M].上海：科学技术出版社，1997：429，431，435.[10]OhnishiM,etal.Inhibitoryeffectsofchlorogenicacidsonlinoleicacidperoxidationandhaemolisis[J].Phytochemistry,1994,36(3):579-583.[11]MACRAEWD，TOWERSGHN.Biologicalactivitiesoflignans[J].Nature，1984,23（6）：1207-1220.[12]张名涛,顾宪红,杨琳.菊粉的原生素作用研究进展[J].动物营养学报，2003，15（4）：12-18.[13]国家药典委员会.中国药典(2005年版一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:48–49.[14]LINSC,LINCH,LINCC,etal.HepatoprotectiveeffectsofArctiumlappaL.onliverinjuriesinducedbychronicethanolconsumptionandpotentiatedbycarbontetrachloride[J].JournalofBiomedicalScience,2002(9):401-409.[15]ISHIMARUM,KAGOROKUK,CHACHINK,etal.Effectsofthestorageconditionsofburdockrootonthequalityofheat-processedburdocksticks[J].ScientialHorticulture,2004,101:1-10.[16]陈茂广.牛蒡枸杞茶饮料的加工技术[J].江苏食品与发酵,2000(1):35-37.[17]樊慧双,章焱广,张春艳.速溶牛蒡冲剂的研制[J].农业科技通讯,2000(3):30.[18]魏东.凝固型牛蒡酸乳的研究[J].食品与发酵工业,2006,32(8):122-125.[19]姚守国.牛蒡营养面包的制作研究[J].安徽农学通报,2007,13(2):144-145.[20]YamaguchiS,TakidoM,SankawaU,ShibataS.OntheconstituentsofthefruitofArctiumlappa51 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