谈青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体pbi121

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1、谈青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体PBI121青蒿素(artemisinin)是我国科学家从传统抗疟中药菊科蒿属的青蒿(ArtemisiaannuaL.)中分离提纯出的含有过氧桥结构的类异戊二烯化合物。其合成的衍生物还有双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，它们在疟疾治疗上具有高效、速效和低毒等特点，已成为疟疾流行地区的灵丹妙药。可是除青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。青蒿虽然系世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大，且含量仅占叶片干重的0.5%左右，最多也不超过1%。本研究拟在克隆青蒿鲨烯合酶基因(SS)的基础上，利用根癌农

2、杆菌Ti质粒衍生的双元载体系统构建反义SS基因表达载体，然后利用实验方法转化青蒿外植体和再生转基因植株，通过阻遏青蒿内源SS基因表达以降低类固醇的合成并将碳流引向青蒿素合成的可能性，最终提高青蒿素含量。　　1材料　　1.1菌种和质粒大肠杆菌DH5α由本实验室保存;pMD-18T载体购自TaKaRa公司;pROKII-SS载体本实验保存;PBI121载体由本校热研所提供;根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)菌株载体购自TaKaRa公司。　　1.2试剂质粒DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自LifeTechnologies公司

3、;聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增试剂盒、Taq酶、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Takara公司。培养基成分及其他常规化学试剂为国产分析纯产品。　　1.3仪器PCR仪;台式离心机;凝胶成像分析系统;台式制冷机;高速冷冻离心机;恒温振荡器;微型凝胶电泳仪;紫外分析仪;压力蒸气消毒器;电热恒温水浴锅;超净工作台;脱色摇床;旋涡混合器。　　2方法　　2.1PCR扩增以实验室的pROKII-SS载体为模板，带有酶切位点的SmaI-SS(5'TCCCCCGGGATGAGTAGTTTGAAAG3'

4、;)、BamHI-SS(5'CGCGGATCCTTACAAAGTGAATTC3')为上下引物，对pROKII-SS进行PCR扩增。扩增条件为:94℃，1分钟→94℃，30秒，后57℃，1分钟，然后72℃，1.5分钟，30个循环→72℃，10分钟→4℃。反应结束后，取5～10μlPCR产物进行电泳检测。　　2.2扩增片段回收长波紫外观看凝胶，切下含扩增片段的琼脂糖部分，将凝胶放入eppendorf管中，按试剂盒说明书操作。以回收的纯化扩增产物调制下列连接反应:1μlsolutionI、1&m

5、u;lpMD-18T载体、5μlPCR产物，3μlH2O、16℃反应过夜。　　2.3大肠杆菌感受态细胞的转化加入3～5μl连接产物至感受态细胞，混匀，冰浴30分钟;42℃热激90秒，迅速冷却1～2分钟，加入1mlLB培养基，37℃振荡培养1.5h;取200μl菌液涂于含100mg/LAmp的筛选平板上，吹干，37℃倒置培养12～16小时。　　2.4重组质粒鉴定挑取单菌落，摇菌并提取质粒，分别经PCR扩增及SmaI，BamHI酶切鉴定。PCR扩增采用Taq酶，反应条件为:94℃，1分钟→94℃，30秒，后57℃，1

6、分钟，然后72℃，1.5分钟，30循环→72℃，10分钟→4℃。DNA酶切反应条件(30μl体系):1.0-2.0μg质粒DNA、3μl10T缓冲液、SmaI1.5μl，BamHI1.5μl，加ddH2O至终体积30μl，置30℃反应2～3小时。　　2.5重组质粒测序重组后的质粒进行测序，核对为反义基因SS且序列正确无误。　　2.6目的基因与超表达载体的酶切经测序后确认SS无误后，将pMD18-SS质粒和PBI121质粒用SmaI，BamHI做双酶切，酶切体系为(30μl体系):1.0

7、～2.0μg质粒DNA、3μl10T缓冲液、SmaI1.5μl，BamHI1.5μl，加ddH2O至终体积30μl，置30℃反应2～3小时。　　2.7目的基因与超表达载体的连接经双酶切的目的基因和表达载体，用纯化试剂盒纯化后，进行连接，连接体系(10μl体系):200ngSS片段、250ngPBI121质粒，1μl10连接缓冲液、1UT4DNA连接酶，加ddH2O至终体积10μl，置16℃反应过夜。　　2.8大肠杆菌转化与鉴定方法同2.3和2.4。　　2.9农杆菌细胞转化与鉴定低温冰箱中取出100&

8、mu;l感受态细胞悬液，室温解冻，立即置冰上，加0.1μgPBI121-SSDNA溶液，轻混匀，冰上放置10分钟。置于液氮速冻5分