脂肪酶的提取与分离纯化

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1、17722960高娜Graduatepaperdefense,ZaoZhuanguniversity.通过PEG/磷酸双水相系统和它的生化特性将脂肪酶从肠球菌MTCC5695中提取及纯化01020304摘要及介绍材料与方法CONTENT02酶活力及酶纯度的影响因素总结01摘要及介绍AbstractandIntroductionPARTONE脂肪酶的来源及性质ATPS系统©脂肪酶的纯化041.1摘要脂肪酶活性的影响因素脂肪酶(Lipase)是一种能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，在生物体内是一种重要的代谢酶，在食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学以及环境、能源等领域也有非常

2、广泛应用。并且细菌的脂肪酶在高温环境下比其他微生物更稳定，能够接受宽范围的PH的变化。脂肪酶的本质可能是碱性或酸性的，而在极酸性的pH值(1.5-2.0)的脂肪酶则来自哺乳动物，如胃脂肪酶。碱性脂肪酶在洗涤剂、食品调味料、皮革加工、医药和化妆品行业等方面有很大的潜力。目前双水相萃取系统（ATPS）作为纯化脂肪酶的一种方法开始越来越被业界接受。本次研究主要探讨粪肠球菌MTCC5695的细胞内脂肪酶的纯化及其表征。另外，MTCC5695的脂肪酶被发现是碱性的，表明它适合在洗涤剂工业中应用。1.2介绍0502材料与方法MaterialsandMethodsPARTTWO07e.fae

3、ciumMTCC5695、聚乙二醇硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氨基酸修饰剂、蛋白标志物脂肪酶的纯化过程进行了双水相体系的参数优化，并且下面描述的所有实验至少重复三次，并报告平均值。PH、温度、金属离子、有机溶剂、修饰剂、组特异性试剂底物和化学物质脂肪酶的纯化脂肪酶的表征2.1脂肪酶的分离纯化双水相萃取技术是近年来基于液－液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型分离方法。是利用生物大分子物质在由高聚物/高聚物/水或者高聚物/无机盐/水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离的。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐(一种是离散盐且另一种是亲液盐)在适

4、当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成了双水相系统。其中两聚合物构成的双水相体系的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(PEG)作为其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐，而轻相富含聚乙二醇，重相富含盐。2.1.1双水相体系的介绍：082.1脂肪酶的分离纯化Albertsson使用云点方法制作出了双节点曲线。通过折射率和电导率测量分别分析了聚乙二醇和盐的浓度。盐的浓度是由一系列标准的盐浓度建立起来的校准曲线决定的。聚乙二醇在相中的固定浓度是通过

5、减去由盐份贡献的折射率值来确定的。2.1.2双水相系统的相图：092.1.3细菌培养以及酶提取：最优条件下，在鱼的排泄物中培养了肠球菌MTCC5695。然后培养物通过冷冻离心机（8000r/s）获得，并且细菌颗粒被重新悬浮到蒸馏水中，再次离心完全去除培养基。然后，这些洗过的细胞颗粒被重新溶解在磷酸盐缓冲液中(pH值7.0)，并储存在零下20摄氏度的环境中。2.1脂肪酶的分离纯化称取预定量的相形成溶质，并加入到粗酶提取物中，使体系的总重量为100％（w/w）在实验过程中，粗酶提取物的重量百分比保持在20％（w/w）。使用磁力搅拌器将内容物充分混合并平衡，并在分液漏斗中分离约2小时

6、。两相清楚分离后，观察体系的顶部和底部的体积，分析脂肪酶活性和总蛋白。所有分区实验在2571℃下重复三次。2.1.4双水相体系的准备：102.1脂肪酶的分离纯化将清洗过的细胞颗粒在磷酸缓冲溶液中进行了超声处理，使得细胞完全分解。为了释放胞内脂肪，0.2克的处理过的细胞被悬浮在1毫升的裂解缓冲液中(0.05m磷酸盐缓冲，pH7)并且为了最大酶的复苏，在冰浴上借助在15KHz的超声波发生器进行了五轮的细胞破坏.超声处理过的细胞悬浮物进行了离心（8000xgfor15min）以及裂解产生的无细胞提取液(LCFE/胞内脂肪酶)被收集。以p-硝基苯乙酸为底物的分光光度脂肪酶测定法被用于L

7、CFE来测定脂肪酶活性。蛋白质的浓度是由使用了考马氏蓝的染料结合法测定的。2.1.5酶活力的估值：112.1脂肪酶的分离纯化分配系数的确定总氮的分配系数是顶相蛋白质与底相蛋白质在平衡浓度下二者的比值。纯化因子的估计脂肪酶的纯化因子被定义为脂肪酶在上/下相的特定活性与粗提物的特定活性的比值。酶活性恢复比例连接线的长度TLL表示连接双水相体系的顶部和底部阶段的组成的线的长度。相体积比相体积比被定义为顶相和底相的体积比。Vt和Vb分别是顶相和底相的体积。2.1.6参数介绍：122.1脂肪酶的分离纯