局灶性脑缺血-再灌注时大鼠脑皮质gfap及c

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1、局灶性脑缺血/再灌注时大鼠脑皮质GFAP及c【摘要】目的研究大鼠局灶性脑缺血/再灌注时皮质区星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与神经元c-fos的表达变化。方法70只大鼠，随机分成缺血组及假手术组，缺血组再根据再灌注时间的不同，分别分为再灌注2、4、6、12、24、48、72h7个亚组，应用免疫组织化学单标记法、蛋白印迹法观察缺血皮质区各时间点GFAP和c-fos表达，用免疫组织化学双重染色法显示2组再灌注4、24、48hGFAP和c-fos表达的相互关系。结果大鼠脑缺血2h再灌注2h神经元c-fos的表达增加，4h达高峰，随之下降，2组间各时间

2、点均有差异（P<0.05）；于再灌注4h星形胶质细胞被激活、GFAP表达增加，随时间延长而逐渐升高，于48h达高峰，随后下降，2组间6、12、24、48、72h5个时间点具有差异（P<0.05）；且在同一部位，c-fos阳性神经元周围伴有激活的星形胶质细胞表达GFAP。结论脑缺血/再灌注时皮质区星形胶质细胞及神经元均被激活，并伴有GFAP、c-fos的不同的时程规律表达变化。【关键词】缺血再灌注星形胶质细胞经元胶质纤维酸性蛋白原癌基因Abstract：ObjectiveTostudythechangesintheexpressionsofa

3、strocytesglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)andneuronalc-fosexpressionafterreperfusionoffocalcerebralischemiainrats.MethodsSeventymaleratsgroupandsevenischemiagroups,munohistochemicalsinglestainingandCAO大鼠缺血脑皮质星形胶质细胞GFAP及神经元c-fos的表达时程变化，以期探讨在脑缺血/再灌注时星形胶质细胞的变化及其与神经元的关系，研究它们在脑缺血中的作

4、用。1材料和方法1.1动物分组体重220～250g成年雄性Sprague-Dag/kg10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，于颈内动脉远心端备线，在颈总动脉近分叉处剪一约0.2mm的“V”形切口，将预先经多聚赖氨酸及肝素处理过的直径为0.24mm的尼龙渔线经该切口顺颈总动脉插入颈内动脉(18±1)mm，感到有轻微阻力时停止，使大脑中动脉起始部阻塞。扎紧备线并固定线栓，缝合皮肤切口，2h后将线栓拔出约10mm，恢复再灌注。麻醉清醒后观察出现右侧Horner综合征、

5、左侧前肢为主的活动障碍后为模型制备成功。假手术组条件同上，置线栓深度为10mm。1.3免疫组化组织材料准备各组中一半动物用过量10%水合氯醛(50mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸经左心室至升主动脉插管，先以150ml生理盐水冲洗血液，随后以4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS先快后慢灌流固定2h后取脑，切取视交叉前2mm至视交叉后2mm脑组织，脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片，片厚4μm，捞片，分套备用。1.4m至视交叉后2mm脑组织，液氮迅速冷冻，-70℃保存待用。1.5免疫组织化学染色切片分套染色，脱蜡至水，高压抗原修复，第1套切片放入3

6、%H2O2溶液中室温浸泡15min后，5%牛血清白蛋白封闭30min后依次入:①兔抗c-fos抗体稀释液(1∶400，Sigma公司)，4℃过夜；②生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温孵育2～4h；③生物素-卵白素-HRP复合物(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1h。DAB-H2O2显色。以上每一步骤之后均用0.01mol/LPBS液充分漂洗3次，每次5min(下同)。第2套切片行抗GFAP（小鼠源，1∶200，SantaCruz公司）染色，步骤如上。第3套切片中挑取4、24、48h切片行GFAP及c-fos双重染色，步骤为

7、先行GFAP的DAB染色，然后重新封闭，入一抗c-fos，碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG（1∶100，SantaCruz公司），NBT-BCIP显色。结束染色的切片经漂洗后晾干、脱水、透明、封固。光镜下观察缺血侧皮质区，取每组4只大鼠8张单标切片40个100倍视野，对c-fos阳性神经元及GFAP阳性星形胶质细胞进行计数。阴性对照实验：取对应时间点切片，用0.01mol/LPBS分别替代抗c-fos、抗GFAP抗体按上述方法进行免疫组化染色，结果为阴性。1.6a公司)及GFAP抗体(小鼠抗大鼠，1∶250，SantaCruz公司)，β-actin抗体(小鼠

8、抗大鼠，1∶500，Sigma公司)中4℃过夜，TBST清洗3次，每次10min；放入稀释好的