骨质疏松骨折愈合过程中tgf┐β1 mrna的基因表达

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1、骨质疏松骨折愈合过程中TGF┐β1mRNA的基因表达　　KeyinggrogroizedfemaleSDrats.METHODSOvariectomizedfemaleSDratsodeloftypeIosteoporosisandosteoporoticfractureandthechangesofgeneexpressionofthetransforminggroalandosteoporoticbonehealingbyinsituhybridization;ThepatternofthegeneexpressionofTGF-β1mRNAilartothenormalinthepro

2、cessoftheosteoporoticbonehealingbydotblothybridization.CONCLUSIONExpres-sionofTGF-β1mRNAisnotrelatedtothepathophysiologicalchangesintheprocessofosteoporoticbonehealing.　　0引言　　转化生长因子β（TGF-β）是骨组织中含量最丰富的细胞生长因子之一［1］，它既具有促进成骨细胞分化增殖，刺激骨形成，又具有支持破骨细胞形成，刺激骨吸收的双重作用，是骨形成与骨吸收之间重要的偶联调节因子［2，3］.另外，TGF-β在骨折愈合过程的不同

3、时期具有促进细胞分化，诱导骨、软骨形成及钙化等作用［4-6］.我们利用去势SD雌性大鼠作为Ⅰ型骨质疏松及其骨折模型，通过原位杂交、斑点杂交，对骨质疏松性骨折骨痂局部TGF-β1mRNA基因表达的细胞定位和表达模式进行了研究，这有助于从基因表达水平深入了解骨质疏松骨折愈合的病生机制.　　1材料和方法　　1.1动物模型的建立所有实验动物选用纯种Sprague-Dao，共120只，随机分为骨质疏松组（OVX）及假手术对照组（Sham），每组随机分为骨折组及非骨折对照组;骨折组以骨折后1，4，9，13及28d又各分为5组，每组均10只.10gL-1戊巴比妥钠（40mgkg-1）ip麻醉下经背侧切口，

4、OVX组行双则卵巢切除术，Sham手术组做双侧卵巢暴露，即关闭切口.术后2mo，骨折组动物ip麻醉下先用0.5mm齿科钢丝行胫骨髓腔内固定术，后用专用大鼠骨折器，于大鼠双侧胫骨中段造成闭合性骨折.分别于1，4，9，13及28d时间段无菌条件下取材，一侧标本多聚甲醛固定、复合脱钙液脱钙、石蜡包埋，0.5μm切片用于原位杂交;另侧标本直接放入液氮冷冻保存，用于总RNA提取.取材范围包括两骨折端及其间组织.　　1.2原位杂交TGF-β1cDNA探针购于北京医科大学免疫教研室，探针标记按地高辛标记及检测试剂盒（宝灵曼公司）说明进行.组织切片脱蜡，0.2molL-1盐酸处理5min，蛋白酶K（10mg

5、μL-1）消化10min，杂交探针浓度为300～50ngmL-1，42℃恒温杂交10～16h.15000封闭液稀释酶标地高辛抗体2h，显色10min，蒸溜水冲洗2min，封片镜检.　　1.3总RNA的提取组织块质量（1g），捣碎加盐酸胍组织裂解液10mL，加5mLL-1十二烷基肌氨酸钠匀浆1min，离心收上清入新管，加入0.1体积3molL-1醋酸钠，加等体积水平衡酚及0.2体积氯仿异戊醇，12000rmin-1离心10min，加入0.6体积异丙醇10min，12000rmin-1离心10min，700mLL-1乙醇洗涤真空抽干，100μLDEPC水溶解，取6μL加水至600μL，紫外分光光

6、度计测定RNA含量.　　图1－图6略　　1.4斑点杂交硝酸纤维素膜8cm×10cm两张，铺膜于真空抽吸打点仪上，加等体积RNA变性液于RNA液中（RNA浓度1gL-1）变性1h，点膜，每一标本样品为一个点，每点总RNA量为4μg，室温干燥，80℃干烤2h，冷却至室温，将2张硝酸纤维素膜分别装入塑料袋，倒入预杂交液10mL，42℃预杂交16h，按浓度15～60μgL-1加入变性的Dig标记TGF-β1cDNA探针，42℃杂交20h，15000封闭液稀释酶标地高辛抗体10mL孵育30min，显色液中显色16h，薄层扫描仪扫描半定量测定.　　1.5实验对照正常对照:采用正常及骨质疏松非骨折组动物的

7、胫骨及其周围软组织切片进行杂交反应;空白对照:采用未加探针杂交液进行杂交反应.　　统计学处理:骨折组同一时间点组间数据及同组不同时间点数据通过SPSS统计软件进行方差分析（ANOVA），非骨折组OVX与Sham组间数据进行均数t检验.　　2结果　　2.1原位杂交结果正常骨折与骨质疏松性骨折愈合过程中TGF-β1mRNA基因表达的细胞定位无差别，且表达模式基本相似.TGF-β1mRNA主要定位于软骨细胞、成骨细