骨质疏松骨折愈合过程中tgf┐β1 mrna的基因表达论文

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1、骨质疏松骨折愈合过程中TGF┐β1mRNA的基因表达论文.freelRNA的基因表达模式及细胞定位.方法利用去势SD大鼠造成Ⅰ型骨质疏松及其骨折模型，通过原位杂交、斑点杂交检测骨痂局部TGF-β1mRNA的表达.结果骨质疏松骨折与正常骨折愈合过程中TGF-β1mRNA基因表达的细胞定位未见差别;TGF-β1mRNA表达的变化模式与正常骨折愈合过程相似.结论TGF-β1基因表达的改变与骨质疏松骨折愈合的病生改变未见关联.KeyinggrogroizedfemaleSDrats.METHODSOvariectomizedfe

2、maleSDratsodeloftypeIosteoporosisandosteoporoticfractureandthechangesofgeneexpressionofthetransforminggroalandosteoporoticbonehealingbyinsituhybridization;ThepatternofthegeneexpressionofTGF-β1mRNAilartothenormalintheprocessoftheosteoporoticbonehealingbydotblothyb

3、ridization.CONCLUSIONExpres-sionofTGF-β1mRNAisnotrelatedtothepathophysiologicalchangesintheprocessofosteoporoticbonehealing.0引言转化生长因子β（TGF-β）是骨组织中含量最丰富的细胞生长因子之一［1］，它既具有促进成骨细胞分化增殖，刺激骨形成，又具有支持破骨细胞形成，刺激骨吸收的双重作用，是骨形成与骨吸收之间重要的偶联调节因子［2.freelRNA基因表达的细胞定位和表达模式进行了研究，这有助于从

4、基因表达水平深入了解骨质疏松骨折愈合的病生机制.1材料和方法1.1动物模型的建立所有实验动物选用纯种Sprague-Dao，共120只，随机分为骨质疏松组（OVX）及假手术对照组（Sham），每组随机分为骨折组及非骨折对照组;骨折组以骨折后1，4，9，13及28d又各分为5组，每组均10只.10gL-1戊巴比妥钠（40mgkg-1）ip麻醉下经背侧切口，OVX组行双则卵巢切除术，Sham手术组做双侧卵巢暴露，即关闭切口.术后2mo，骨折组动物ip麻醉下先用0.5mm齿科钢丝行胫骨髓腔内固定术，后用专用大鼠骨折器，于大鼠双

5、侧胫骨中段造成闭合性骨折.分别于1，4，9，13及28d时间段无菌条件下取材，一侧标本多聚甲醛固定、复合脱钙液脱钙、石蜡包埋，0.5μm切片用于原位杂交;另侧标本直接放入液氮冷冻保存，用于总RNA提取.取材范围包括两骨折端及其间组织.1.2原位杂交TGF-β1cDNA探针购于北京医科大学免疫教研室，探针标记按地高辛标记及检测试剂盒（宝灵曼公司）说明进行.组织切片脱蜡，0.2molL-1盐酸处理5min，蛋白酶K（10mgμL-1）消化10min，杂交探针浓度为300～50ngmL-1，42℃恒温杂交10～16h.1500

6、0封闭液稀释酶标地高辛抗体2h，显色10min，蒸溜水冲洗2min，封片镜检.1.3总RNA的提取组织块质量（1g），捣碎加盐酸胍组织裂解液10mL，加5mLL-1十二烷基肌氨酸钠匀浆1min，离心收上清入新管，加入0.1体积3molL-1醋酸钠，加等体积水平衡酚及0.2体积氯仿异戊醇，12000rmin-1离心10min，加入0.6体积异丙醇10min，12000rmin-1离心10min，700mLL-1乙醇洗涤真空抽干，100μLDEPC水溶解，取6μL加水至600μL，紫外分光光度计测定RNA含量.图1－图6略1

7、.4斑点杂交硝酸纤维素膜8cm×10cm两张，铺膜于真空抽吸打点仪上，加等体积RNA变性液于RNA液中（RNA浓度1gL-1）变性1h，点膜，每一标本样品为一个点，每点总RNA量为4μg，室温干燥，80℃干烤2h，冷却至室温，将2张硝酸纤维素膜分别装入塑料袋，倒入预杂交液10mL，42℃预杂交16h，按浓度15～60μgL-1加入变性的Dig标记TGF-β1cDNA探针，42℃杂交20h，15000封闭液稀释酶标地高辛抗体10mL孵育30min，显色液中显色16h，薄层扫描仪扫描半定量测定.1.5实验对照正常对照:采用正

8、常及骨质疏松非骨折组动物的胫骨及其周围软组织切片进行杂交反应;空白对照:采用未加探针杂交液进行杂交反应.统计学处理:骨折组同一时间点组间数据及同组不同时间点数据通过SPSS统计软件进行方差分析（ANOVA），非骨折组OVX与Sham组间数据进行均数t检验.2结果2.1原位杂交结果正常骨折与骨质疏松性骨折愈合过程中TG