肿瘤相关基因分析方法

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1、肿瘤相关基因分析方法综述·肿瘤相关基因分析方法同济医科大学附属协和医院《武汉430030)胡慈综述易粹琼王家耽审校肿瘤的发生发展是多因素多基因长期作用的结果。克隆肿瘤相关荃因的方法有多种，且根据不同的分类有不同的侧重点。本文以研究对象水平的不同概括为三大类:第一类从DNA水平入手;第二类以mRNA水平为基础;第三类以蛋白质水平为基础。以DNA水平为甚础肿瘤相关基因改变的类型多种多样。有的基因在基因组结构上发生改变，如发生基因重排，抗癌基因丢失，原癌基因突变等。从DNA水平入手即可克隆这类基因。方法分述于下。1.1定位克隆定位克隆是当前克隆肿瘤易感基因的

2、一条主要途径。它的一般程序包括:首先采用分离分析确定疾病的遗传方式，然后通过对家系进行连锁分析把遗传易感基因定位在染色体的特定区带，再通过染色体步移或染色体跳步获取覆盖这一区域的DNA克隆群并在此基础上获得候选基因的cDNA片段，最后分析这些候选基因在患者和其它家系成员中体细胞和生殖细胞的突变情况以找到真正的肿瘤易感基因。1.1.1基因在染色体上的定位这是关键性的步骤，工作量较大，周期也较长。大部分类型肿瘤为多基因疾病，基因之间相互作用方式难以预测，需大量精确的家系资料。基因定位的主要手段是连锁分析，即通过基因与染色体上多态性DNA标记之间的重组系数来

3、估计两者之间的距离。用于定位克隆的DNA标记包括限制性片段长度多态性(RFLP)、可变数目窜联重复闭、徽卫星DNA等。这是经典的遗传学方法，得出的定位结果较精细，但要求两代以上的系谱材料为基础，且不适合研究微效基因，于是关联分析方法应运而生。该方法不要求大的家系，只需在患者和他们的双亲中进行研究，也适合微效基因的定位，如PTC基因的定位。1.1，2获取覆盖候选区域的cDNA片段cDNAR的筛选可先通过计算机预测然后进行实验确定。将肿瘤相关基因定位在染色体上某一局限位置后检索GENBANK核酸和蛋白质数据库并与其它种类生物同很序列相比较以寻找候选的cDN

4、A序列。另外也可直接通过实验确定有关的表达序列，如杂交吸附筛选法、外显子捕获法、CpG岛筛选法、直接用基因组DNA与cDNA文库杂交法、外显子扩增法、种间同镇序列杂文法、筛选剪接位点法、编码序列富集法、直接筛选PCR法等。每种方法各有长处也各有缺陷，需联合使用几种方法才能完全筛选到候选区域存在的。DNA序列。1.1.3基因功能的鉴定在获取候选区域的cDNA后要逐个检测它们在患者及其它家系成员中体细胞和生殖细胞改变的情况，对基因编码蛋白质的氮基酸序列进行分析，以进一步鉴定其功能，并可行转基因或基因敲除来分析与肿瘤的关系。1.2代表性差异分析RDA采用识别

5、六碱基的限制性内切酶消化基因组DNA，将其复杂性降低，再通过多轮消减杂交结合PCR反应使差异性的靶基因片段得以大量富集。1.2.1接头和引物的设计需设计几对一长一短的两个寡核苷酸片段连接于酶切后的DNA片段的末端。其中长的作为相应的PCR引物，一对制备扩增子，另外2一4对用于杂交和扩增过程之中。相连的两轮PcR反应中不能用相同的一对接头。1.2.2制备扩增子扩增子是DNA经限制性内切酶消化后连上接头并经PcR扩增的片段。它具有两个特点:其一，大大降低了基因组的复杂性，使扩增效率提高;其二，将驱赶子于检测子之间的差异转化为限制性内切酶位点之间的差异，从而

6、可将制备的探针用于遗传学分析或基因定位等方面。1.2.3差异性富集它是动力性富集和PcR两方面的结合。反应开始时检测子和过量的驱赶子变性杂文，在这一过程中靶序列即成动力性富集。然后进行PCR反应，驱赶子中缺乏存在于检测子中的靶序列，反应的结果是同聚体两端由于有两个接头故呈指数扩增，而杂交体只有单链有接头故呈线性扩增。这样经过多富集靶序列得以显著增加。1.3比较基因组杂文它是一种荧光原位杂交技术。它采用等量肿瘤基因组DNA和正常对照基因组DNA作为探针与正常人中期染色体标本进行原位杂交，然后根据荧光信号强度差异找出基因组中差异区域，将荧光显微镜与电脑彩色

7、图象分析系统连接，对两种萤光比值进行定量。它对于实体瘤基因组水平上的研究有重要价值。然而，CGH不能检测平衡易位、重排及其它没有拷贝数变化的异常，而且依赖于扩增水平的高低及受累区域的大小，因此需同其它遗传学技术相结合。1.4AP.PCR它是在对所扩增的基因序列一无所知的情况下，采用随机设计的一或两个非特异性引物，在高镁离子浓度、低复性温度条件下使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在则可使二者之间的DNA片段得以扩增。扩增产物经电泳分离可得到DNA指纹图。通过对不同来源基因指纹图的比较即可找出差异片段。

8、AP.PcR是一种半定量的方法，不仅可用于检测基因结构的变化，而且能检测出多倍体及杂合性变化。