肿瘤相关k-ras基因热点突变检测方法及血游离dna标本分析

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3、：利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关结合实时荧光定量PCR技术，建立对K。ras基因7个热点突变同时进行快速筛查的技术平台，采用多重PCR和单重PCR相结合，通过扩增曲线和熔解曲线判断7个热点突变的存在与否，并可以对突变进行半定量分析。检测K．ras基因相关突变的有无，可用于对肿瘤的发生进行预测，指导肠癌以及其他肿瘤患者的合理用药并对肿瘤进行预后分析。方法：将包括K—ras基因12，13号密码子在内的PCR产物克隆至PGEM．T载体，通过LB／Amp平板筛选阳性克隆，挑选菌落进行培养并提取质粒DNA。对质粒DN

4、A进行PCR扩增初步确定阳性克隆并通过测序分析得到确证，获得K．ras基因野生型质粒模板。采用重叠延伸定点突变技术，得到了7种突变基因型PCR产物，将此7种PCR产物与PGEM．T载体相连接，再次转化E．coliJMl09感受态细胞，筛选阳性克隆，测序鉴定得到K-ras基因7种热点突变的质粒模板。进一步设计与K．ras基因7个热点突变配对的3’末端硫化修饰正向引物，并在其下游设计一条公共反向引物，同时设计与野生型基因模板相配对的分子开关检测引物，分别构成特异性突变检测引物与特异性野生检测引物。对K．ras基因野生型质

5、粒模板和7种突变型质粒模板，进行高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关检测，结合荧光定量PCR技术对7对突变检测引物的检测特异性及敏感性进行分析并优化单重PCR及多重PCR的反应条件。采集正常人以及肿瘤患者的组织或血样标本，通过临床样本对检测方法进行评估，并对肿瘤样本进行k．ras基因7个热点突变的筛查。结果：在一定的反应条件及反应体系下，特异性野生检测引物与野生模板配对得以延伸；而与突变模板不配对则不能延伸。当特异性突变检测引物与突变模板配对，引物得以延伸；而与野生模板不配对则不能延伸。突变敏感性分子开关技术对

6、20例正常人的基因组DNA以及1份含有200例正常人基因组的DNA池标本进行检测，特异性突变检测引物无一例有扩增产物，而特异性野生引物均有扩增产物，与测序结果一致，证实此“分二子开关"技术的检测特异性高。突变敏感性分子开关对15例肺癌组织DNA标本进行筛查，5例经特异性突变检测引物扩增中文摘要肿瘤相关K—ras基因热点突变检测方法及血游离DNA标本分析后有目的产物；从14例肿瘤患者血浆中提取的游离DNA样本，经特异性突变检测引物扩增后3例有目的产物，以上肿瘤标本的检测结果与测序结果一致。由此可以看出，突变敏感分子开关

7、对体细胞突变的检测具有很好的特异性及敏感性。结论：高保真酶介导的突变敏感性分子开关可用于已知基因突变的检测，除可用于检测外周血白细胞DNA的遗传性突变外，还可以检测血中游离DNA中存在的微量体细胞基因突变。高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛查K．ras基因的7种突变，该技术在K．ras基因筛查中具有较大的潜在应用价值，对肿瘤的预警，指导用药以及预后分析具有重大的意义。关键词：肿瘤；K-ras突变敏感性分子开关；荧光定量PCR；血中游离DNAII作者：王庆琳指导教师：李凯肿瘤相关K．1

8、'aS基因热点突变检测方法及血游离DNA标本分析英文摘要Developmentofansootmutationsand●_Objective：assayforcarcinogenicK--rashotits001icatio‘。：ulatingDNAitsaOOliCatloninclrculatlngAbstractToestablishaP