土壤微生物生态学研究方法进展

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1、蔡燕飞等：土壤微生物生态学研究方法进展5土壤微生物生态学研究方法进展蔡燕飞，廖宗文华南农业大学资源环境学院，广东广州510642摘要：土壤微生物研究方法经历了微生物纯培养、土壤酶活性（BIOLOG微平板分析）、微生物库（如微生物生物量）和流（C和N循环）、微生物生物标记物（FAMEs）、微生物分子生物学技术（从土壤中提取DNA，进行PCR-DGGE、PCR-SSCP、RLFP分析等），揭示了土壤微生物群落丰富的多样性和生态功能；现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为土壤微生物学研究提供较好的前景。关键词：土壤微生物生态

2、；酶；微生物生物量；生物标记物；分子生态中图分类号：S154.3文献标识码：A文章编号：1008-181X（2002）02-0167-05蔡燕飞等：土壤微生物生态学研究方法进展5土壤微生物学最本质的问题是微生物生态学的问题。本文旨在对这领域的研究作个回顾，介绍一些新方法，对将来土壤微生物研究作出展望。1微生物纯培养传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。随着人们对土壤中微生物的原位生存状态研究，越来越发现常

3、规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能[1]的信息。纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，有些方法对土壤微生物研究并不很适合，譬如在自然土壤生态环境下许多土壤微生物处于贫营养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤活细菌的总数，大量的贫营养微生物不适宜生长，测定结果误差大；一般实验室在分离培养土壤细菌时通常只是在28℃下培养。尽管土壤中存在高温型细菌，但土壤中的低温型细菌则被忽视了。由于传统的平板培养方法只能反映极少数微

4、生物的信息，这些研究不能充分了解土壤微生物生态功能，也埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。2土壤酶用生物化学技术能快速地检测土壤酶活性，使土壤酶学研究在60年代后期至80年代比较热门，其中尿酶[2]、磷酸酶[3]、脱氢酶[4]在土壤中的含量和变化规律研究较多。但土壤酶测定方法用于土壤微生物研究的一个致命弱点是不能直接的反映土壤实际微生物状况。Visser等对酶检测用于土壤微生物群落和土壤质量评价提出了怀疑[5]。Skujins(1978)认为脱氢酶本身的生物化学特征决定了它不可能以胞外酶状态存在于土壤中[6]。为了解决土

5、壤酶测定中的评判问题，Beck（1984）提出了土壤微生物如微生物量（microbialbiomass）、还原酶（reductase）、水解酶（hydrolase）的适宜指标，然而，这些指标从来没有被广泛采用。Beck（1984）和Trasar-Cepedaetal.（1998）认为把酶用于土壤质量评价指标是值得怀疑的，而且缺乏常规可行的酶测定手段，存在药品昂贵等问题[7，8]。Community-levelphysiologicalprofiling(CLPP)是由GarlandandMills（1991）提出的另一种酶

6、分析方法[9]，微生物群落降解95种不同单一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOGGN微平板较多应用于研究土壤和环境微生物区系。作者采用BIOLOGGN微平板培养分析施用生态有机肥对土壤微生物多样性和番茄青枯病的影响，结果表明，连作地施用生态有机肥后，番茄青枯病显著降低，土壤微生物多样性显著提高[10]蔡燕飞等：土壤微生物生态学研究方法进展5。由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解四氮叠茂，此方法只能检测微生物群落细菌（主要是革兰氏阴性菌）中快速生长的那部分微生物信息。不同的微生物对同一碳源的利用能力是有差异的，微生物对不同单

7、一碳源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对碳底物实际利用能力的改变，同时在温育过程中存在适应性问题如代谢补偿、代谢适应等。但CLPP方法因快速、简便而受到人们的欢迎，因而有专用于土壤和环境微生物生态研究的生态微平板（EcoPlates）（Insam，1997）[11]。土壤酶测定方法至今没有一个标准的参数和测定标准，不能对土壤微生物生态功能一个准确的答案，若要充分分析土壤特征，了解不同土壤之间的差异，一定要与其他的方法相配合。3

8、流（fluxs）土壤微生物是土壤生态系统中库（pool）和流的一个巨大的原动力。土壤酶测定一般要在适宜的条件下测定，不能作为土壤物流的原位评价。库和流的计算对土壤微生物学家来说很重要，测定土壤微生物呼吸（CO2的释放量），是较好的微生物群落总代谢活性指标[12]。N、NO3输入引起土壤酸化，甚至引起地下