土壤微生物群落结构研究方法进展①

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1、DOI:10.13758/j.cnki.tr.2004.05.004土壤(Soils),2004,36(5):476~480①土壤微生物群落结构研究方法进展张瑞福崔中利李顺鹏（南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095）摘要分离培养技术在土壤微生物的研究中有很大的局限性，因为土壤中的微生物大部分还处于不能被分离培养状态。随着微生物研究技术的发展尤其是分子生物学技术的发展，一系列不依赖于培养的技术在土壤微生物研究中得到广泛应用。本文介绍了生物标志物法、SCSU、DNA复性分析、DGGE、TGGE、ARDRA、T-RFLP、SSCP、PAPD和ERIC-P

2、CR图谱分析等方法在土壤微生物群落结构研究中的应用。关键词微生物群落结构；不依赖培养；研究方法中图分类号Q938土壤是一个极为复杂的生态体系，土壤微生物群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物[3]学一直被认为是研究中的“黑匣子”（blackbox）。许细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代[1,2]物只占环境微生物总数的0.1%~10%。传统的土谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生壤微生物研究方法如分离计数法、显微镜法往往会物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有过

3、低估价土壤微生物的群落结构组成，虽然使用电属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物子显微镜或荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂[4]多样性进行观察，但是这两种方法并不能描述出土肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘PLFA谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通出不同群体的生理差异。随着微生物研究技术的发过谱图的变化得到快速有效的监测。甲基脂肪酸酯展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学家是细胞膜磷脂水解产物，该法利用MIDI系统（一开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法。种

4、气相色谱分析系统）分析出全细胞的FAME谱图。[5]WilkinsonSC等人用PLFA谱图法找出了微生物群1生物标志物（Biomarker）法落与树木根系的关系。[6]使用生物标志物来定量描述土壤微生物的群落Haack等人通过试验验证了FAME谱图法分结构组成是最常用的方法之一。这种生物标志物通析土壤微生物群落的可行性，还同时进行了生物量、常是微生物细胞的生化组成成分或是细胞外分泌产分类结构实验，结果表明FAME谱图法能够监测土物。当测定土壤中这些化合物时，首先使用一种合壤微生物群落细微变化。为人们提供了一个监测土适的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提壤微生物群落结构

5、的常规方法。[7]取物进行纯化后用合适的仪器加以定量测定。用这YaoHuiying等应用PLFAs分析了8个不同肥种方法来定量描述土壤微生物的群落结构组成的优力水平和种植历史的中国红壤的微生物群落结构，点是既不需要把微生物的细胞从环境样中分离，同发现PLFAs总量与土壤有机C、总N、微生物量C时又能克服由于对微生物培养而导致不同微生物种和基础呼吸呈显著正相关，种植历史和植被类型对群可能会发生选择性生长所造成的麻烦。土壤微生物群落结构有很大影响。磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）图FAME分析法为种内关系的建立提供了一个快谱分析、脂肪酸（fatt

6、yacid,MFA）谱图以及甲基脂速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的肪酸酯（fattyacidmethylester,FAME）谱图分析在FAME有可能重叠，因此在区分关系较远的微生物①国家高技术研究计划资助项目（2001.AA214121和2001.AA246081）。第5期张瑞福等：土壤微生物群落结构研究方法进展477应用上有一些困难。但以FAME的多样性来表示一得到的DNA是各种不同类型微生物DNA的混合个不太复杂的生态系统的生物多样性仍有一定的参物，其比例也有着很大的差异。C0t1/2值提供了DNA考价值。复杂性的资料。目前，已将C0t1/2作为多样性的指标

7、，它是测定群落总的遗传复杂性的方法之一，它2BIOLOG微平板研究单一碳源底物利用能反应了群落中信息的量以及这些量是如何分布的。力（Sole-Carbon-SourceUtilization，SCSU）[12]Torsvik等用DNA复性试验研究了挪威一处该方法最初由美国的BIOLOG公司于1989年山毛榉树林土壤的微生物群落多样性。根据试验结开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经果估计每克土壤中大约有4000种微生物。能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000多种土壤总DNA复性分析是较早应用