土壤微生物研究土壤采集方法

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1、土壤微生物研究规范——II.土壤样品的运输和贮存1.土壤微生物样品的运输土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内

2、完成前期处理。如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下：（1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。（2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输

3、，也可用干冰。（3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。（4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放

4、置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地的冰箱是否留有足够空间存放土壤样品或者浸提液样品。特别要注意微生物样品的密封，放置融化的水分或者其他污染源污染样品。2.土壤微生物样品的处理采样后土壤样品应尽快处理手工过筛。过筛之前，去除样品中的植物、可见土壤动物和石粒等。推荐过2mm筛，促进颗粒间的气体交换，以利于保持土壤的好氧状态，也能去除小石头、动物和植物碎片。一些有机物质如粗腐殖质或泥炭不容易通过2mm筛，此时应在潮湿条件下过5mm筛。如果土壤太湿不能过筛，应该将其摊开，置于轻微流动的空气中，促其均匀风干。应不停地用手指捏碎并翻动土壤以免表面过

5、度干燥，通常在室温下进行上述操作。如果土壤需要风干，不要过度风干，风干程度达到过筛要求即可。3、土壤微生物样品的储存土壤微生物样品管理和制备过程相对特殊，因此对土壤微生物样品在实验室内分析阶段的储存需要特别注意对储存条件和储存时间的控制，以保证检测结果准确。2.1微生物样品储存条件根据土壤微生物的观测指标、样品状态等的不同，对样品储存条件的要求如下：1）微生物生物量分析一般要求土壤鲜样置于4℃左右冷藏保存，可放在冰箱冷藏室或者事先放置冰板或冰块的保温箱中，不能处于冰点以下，以免冰冻影响微生物。一般的菌种保存也大多是在4℃，这个温度可以减小细胞繁殖，维持微生物区系的稳定性。2）土壤微生物

6、样品经过熏蒸浸提等前处理后的浸提液样品置于-20℃左右的环境中冷冻保存。3）微生物多样性分析中Biolog板法、PLFA法或者DNA测序时大多都是采用冷冻法保存土样，且为了避免由于冷冻速度过慢导致菌体会表达大量的抗逆性基因和蛋白，样品可以速冻后（液氮罐），保存在超低温冰箱中（-70℃）。4）尽量减少开关冰箱或保温箱，以保证恒定低温效果。如遇停电等突发事件，做好相应应急处理措施。5）特别要注意微生物样品在实验室保存和分析过程中的密封，以免凝结的水汽或其他污染源对样品造成污染。6）每份样品保存量不能过多，不同样品之间避免堆叠，以免下部样品由于挤压形成厌氧环境。2.2微生物样品的储存时间1）

7、待测样品的短期保存对于不同微生物种类的最适宜保存温度并不相同，低温也可以造成某些微生物的死亡，到目前为止尚不能确定低温确实可以保持原有微生物区系不变，因此土壤微生物样品要求在最短的时间内分析。一般认为土壤鲜样4℃下可保存一周，土壤浸提液-20℃下可保存一个月。ISO10381认为一般土壤微生物样品在进行分析前最长可以保存3个月，如果用于DNA分析应保存在-20℃条件下，用于RNA分析则保存在-80℃条件下。2）土壤微生物样品的长期保存（大于3个