微生物研究进展chapter5 分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用

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1、第五章分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用农学系生物技术专业课程《微生物学研究进展》一、微生物分子生态学的理论二、微生物分子生态学的研究方法三、展望墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。1、传统培养法的瓶颈微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于什么

2、原因？各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围。一、微生物分子生态学的理论2、微生物分子生态学的产生为了突破传统纯培养方法的限制，必须要有一种能绕过纯培养这一步的新技术，来推动微生物多样性的研究。微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究由细胞水平深入到分子机制研究水平,提出了微生物分子进化和分子适应等全新概念,使微生物生态学理论更加接近自然本质。3、微生物分子生态学的概念利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律的科学

3、。主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应性发展及其分子机制等微生物生态学基础理论问题。墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。环境微生物群落微生物代谢生理学方法生物化学方法分子生物学方法呼吸醌指纹法脂肪酸指纹法PLFABIOLOG法杂交法基于16SrDNA方法宏基因组核酸探针杂交荧光原位杂交FISH16SrDNA克隆文库DGGE/TGGESSCPT-

4、RFLP、ARDRARFLP、RISARADP、ERIC等基因芯片技术二、微生物分子生态学的研究方法1、研究路线分析方法方法类别原理优点缺点分子杂交核酸探针杂交DNA的变性、复性及其在复性过程中的碱基配对原则、探针与靶分子的特异性结合过程简单避免PCR偏差影响杂交分析结果的因素复杂，只能用来检测事先已知其目标基因序列的微生物FISH人工合成的荧光或放射性标记探针与微生物基因组杂交操作简单，可原位检测，检测灵敏度高只能对特定类群的微生物进行研究其它分子生物学方法RFLP序列差异引起限制性内切酶酶切位点的差异

5、信息量大重复性高周期长，过程繁琐RAPD利用随意设计的非特异引物简单、迅速重复性低ERIC肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定位的差异引起两个ERIC之间序列的多态性结果稳定重复性好灵敏度高PCR反应本身的扩增和偏差可能会产生假阳性，不能对群落中感兴趣的菌进一步研究分析方法方法类别原理优点缺点基于16SrDNA的方法16SrDNA克隆文库可以用来揭示不同物种的系统进化关系反映各种微生物种类构成和亲缘关系工作量大，成本高，不能对目标种群进行原位和实时的检测DGGE不同的变

6、性剂浓度，解链之后电泳速度将会急剧下降DNA片段纯化后可以直接用于测序分辨率低，被分析的片段不能大于400bpTGGE温度梯度，利用不同序列结构的DNA，双链具有不同的熔点温度Tm同上同上SSCP长度相同但序列不同的单链DNA具有空间构象上的差异操作比较简便价格低廉灵敏度和重现度差，150～400bp最佳的分离效果ARDRA16SrDNA序列的差异，限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量不同的DNA片段分辨率高对图谱进行定量化解析和进行群落间的比较都十分困难T-RFLPPCR扩增中所用引物的一端或两端带有

7、荧光标记方便快捷分辨率高灵敏度高复杂群落多样性的低估、影响因素多、无法对微生物定性分析RISA核糖体区间序列多态性操作简单、序列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性2、荧光原位杂交（FISH）利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，对DNA或RNA进行定性或定位分析。2、基于16SrDNA的指纹图谱法为什么选择16SrRNA基因作为微生物进化的遗传标记?方法：16SrDNA克隆文库/ARDRADGGE/TGGERFLP/T-RFLPRISA（I

8、TS）SSCP⑴构建16SrDNA克隆文库环境样品提基因组扩增混合基因组16SrDNA与载体连接，转入感受态细胞微生物群落结构信息挑取单克隆鉴定是否为阳性克隆酶切、PCR方法鉴定全部阳性克隆测序与数据库序列比对系统发育分析阳性克隆鉴定PCR扩增所有16SrDNA片段两种或两种以上四碱基限制性内切酶酶切内切酶图谱分型每种类型挑选1-3个克隆测序序列比对及分析由于载体与DNA片段一一对应，可得到单个DNA片段重组质粒，转化时过程中