维生素c对糖尿病肾病大鼠hspg表达的影响

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万方数据·42·A＆03联用bcr／ablSiRNA可明降低如03的用量达到相同的抑制效果，提高细胞对如q的敏感性，从而减少A盟03毒副作用的发生。SiRNA与ASODN作用效能的明显差异可能与它们起作用的方式不同有关，ASODN通过阻断核糖体与mRNA的结合，同时诱导RNaseH，降解mRNA。SiRNA通过形成RISC复合物，使SiRNA反义链更高效地结合降解靶mRNA，从而更有效地抑制目的蛋白的表达，抑制飚62细胞的增殖。本实验结果显示，在相同作用位点及相转染条件下，SiRNA对K562细胞的抑制作用与百倍浓度的同靶点的ASODN相当。而且，在相同分子浓度的情况下，垡磐坦骘丛鲤鲤』堡!型地：型：型：望：№：!SiRNA能够比ASODN更明显的提高细胞对如03的敏感性，显示了RNAi技术的运用于CML治疗的良好前景。参考文献[1]SrEPHANIES，CATHERINEMV．BCR／ABL：floramoleculermeeha．nisnas0fleukemiainductiontoIrealment0fchronicmydogenousleukemia[J]．Oncogene，2002，21(2)：8547—8559．[2]MONIKAW，UTAF，WlIHELMW，eta1．killing0fleukemicceilswithaBCR／ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi)[J]．Oltlcogene，2002．21(37)：5716—5724．[3]YAlRD，THOMAST．siRNAs：applicationsinfunctionalgenomicsandpotential∞therape幽EJ]．DrugDiscovery，2004，3(2)：318—329．(收稿日期：2005—05—26编辑：祝华)维生素C对糖尿病肾病大鼠HSPG表达的影响*李强翔文格波雷小勇谢小英陈梅贵邓小金南华大学附属第一医院临床医学研究所(湖南衡阳421001)【摘要】目的观察维生素c对糖尿病大鼠肾小球硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSm)表达的影响。方法利用链脲佐茵素腹腔注射法诱导建立1型糖尿病大鼠模型，将实验用sD大鼠随机分正常对照组、糖尿病组、维生素c治疗组。治疗16周，观察治疗期间及治疗后大鼠的一般状况、血糖、尿素氮、血肌酐，内生肌酐清除率、24h尿蛋白排泄率，免疫组织化学检测肾小球基质HSPG表达。结果①造模组大鼠均出现肾脏功能有损害②维生素c对血糖无影响，但能改善基本状况，降低糖尿病大鼠的尿素氮、血肌酐、24h尿白蛋白排泄率，增加内生肌酐清除率，lISP(；表达显著升高。结论维生素c无降糖作用，但具有确切的肾脏保护作用。【关键词】维生素c糖尿病肾病模型HSPG糖尿病肾脏并发症是糖尿病患者致残和过早死亡的主要原因，早期防治糖尿病肾病(diabeticnephropa．thy，DN)药物有重要的临床意义和社会价值，但目前尚缺乏满意治疗的药物。是肾小球系膜操作的标记物，用以反映细胞外基质及其相关物质的合成动态，在糖尿病合并症早期病理变化的研究中是重要指征，在糖尿病肾病发病中起重要作用u’2J，抑制氧化糖基化可延缓或减轻糖尿病肾脏并发症，故我们拟以药物抑制糖基化和氧化应激两个方面为出发点，通过观察维生素C肾小球HSPG表达的影响，从而探讨维生素C对糖尿病肾病的保护作用的机制。1材料与方法1．1实验动物雄性SD大鼠50只，2个月龄左右，体重200～250g，清洁级；由湖南农业大学动物部提供。实验期间自由饮水，摄食饲料为中南大学动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。室温18～28℃，相对湿度62％～80％。*湖南省教委资助项目(编号：978103)1．2仪器和试剂怡成SE悯手持式快速全血葡萄糖测试仪，日丽7170型型自动生化，FJ一2008型免疫细胞记数仪(国营二六二厂生产)，维生素c(vitc，天津药业焦作有限公司，批号：040217—1)；S—P免疫组化染色试剂盒、兔抗鼠硫酸乙酰肝素蛋白多糖(anti—heparinsulfateproteoglycanprotein，anti一唧)抗体由北京莱博生物实验材料研究所提供。链脲佐菌素(Strep．tozotocin，STZ，Sigma，Co．USA)；将0．1mraol／L柠檬酸钠缓冲液(pH4．5)配成0．45％之溶液，使用前经微孔滤过除菌。每天1g维生素C溶于1L水【3j自来水饮用。免疫组化染色载玻片洗净，干燥分别放人以1：10比例去离子稀释的多聚氨酸及多聚氨酸(含有1／1000DE．re)的溶液中，浸泡5min，60℃烤箱烘烤1h干燥，装盒，备用。1．3方法1．3．1动物建模大鼠预养1周后，空腹12h，腹腔注射1％STZ一柠檬酸钠缓冲液(STZ60mg／kg体重)。对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液，依据72h后尿糖(+++～++++)，静脉采血测血糖(怡成全血葡萄糖测 万方数据亡丕匡堂!堂生!旦箜型鲞箜!塑试仪)血糖≥16．7mmolfL者，确定模型建立，纳入本实验。除去造模失败及死亡大鼠，将30只糖尿病鼠纳入本实验。1．3．2分组①正常对照组(on组10只)；糖尿病鼠随机分为②糖尿病组(D组10只)，③维生素C治疗组(D+c组10只)，为了避免酮症和维持糖尿病鼠的生存，②③组隔日腹腔注射长效胰岛素2—4U，并断尾取血测大鼠血糖，使血糖波动在25rmnol／L左右，实验共16周。1．4标本采集第16周实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24h尿，测定尿白蛋白(uAE)含量，动物经乙醚麻醉后称体重，股动脉放血5lIll测大鼠血糖、尿素氮、血肌酐，计算内生肌酐清除率。然后背部作纵形切口，取出肾脏，右肾称重，取左侧肾脏反复灌洗至发白，剔除包膜，横断切取约0．5眦3柱状体2块，置于4％多聚甲醛(含1：1000焦碳酸二乙酯)中固定，固定12h，石蜡包埋，连续切片，4肿厚者用于皿染色，6／an厚者切片用于免疫组化染色。1．5观察指标动物一般情况观察：每El观察大鼠饮食饮水量、精神状态、活动情况、大便性状及尿量、隔日测体重并加以记录。连续2d记录每只大鼠的饮水量、尿量(用代谢笼收集尿液)，去其平均值作为最终数据。肾脏湿重：去包膜后用精密天平称重。生化指标：用全自动生化仪测血糖、尿素氮、血肌酐。尿自蛋白排泄率(urinaryalbuminexcretion，u墟)：收集24h尿液，用二甲苯防腐，混匀后取2rnl用免疫细胞记数仪测定。肾小球滤过率(GFR)：以内生肌酐清除率为代表，GFR=(尿肌酐×尿量)÷血肌酐1．6免疫组化检测操作步骤S—P免疫组化染色试剂盒采用生物系标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及低物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原，染色主要过程如下：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗3次，每次3rain(3×3)。②根据抗体的要求，对组织抗原用浓度为0．05％胰蛋白酶消化，消化时间为37℃、10．40min，③每张切片加1滴50U过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min。④PBS冲洗3X3。⑤甩去PBS液，每张片加1滴或50m的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10min。⑥甩去血清，每张切片加1滴或50m的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60min或4℃过夜。⑦PBS冲洗3×3。⑧甩去PBS液，每张切片加1滴或50皿的生物素标记的第二抗体(试剂c)，室温下孵育10min。⑨PBS冲洗3×3。⑩甩去PBS液，每加1滴或50出链霉菌抗生物一过氧化酶容液(试剂D)，室温下孵育10min。⑩PBS‘43‘冲洗3×3，⑩甩去PBS液，每张切片加滴或100m新鲜配制的DAB，显微镜下控制显色时间，阳性显色为棕色。⑩自来水冲洗，苏木素复染。0．1％HCl分化，0．1％氨水或PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固。阳性结果(主要在胞浆)显棕黄色，以PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化结果图像分析：采用计算机显微图像处理系统，在400放大倍数下每张片子随机选取10个视野区，对杂交信号结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为表达量的值(平均数±标准差表示)。参数如下：灰度值148；窗体：长=127，高=64；X轴=128，Y轴=81。1．7免疫组化结果定性判别方法在显微镜下根据作色程度按以下标准判定结果。阴性(一)：无黄色；弱阳性(+)：淡黄色；阳性(++)：黄色；强阳性(+++)：深黄色或黄褐色。1．6统计学方法采用SPsS10．0软件均数间比较采用AN()VA，配对资料采用配对均值f检验。2结果2．1造模过程大鼠一般情况观察正常组：大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。糖尿病大鼠：精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、弓背蛇体、多汗出、毛竖无光泽、小便量多，每天需换垫料1～2次；有1只视力下降；有2只白内障；有1只出现反复腹泻。治疗各组：精神状况良好，无白内障及尾、足坏死，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差。2．2药物对大鼠尿量、体重、肾重／体重、血糖的影响造模成功的大鼠体重与正常组比较，明显下降，尿量增加，血糖升高，差异显著(P