痛痹颗粒冲剂对il1a诱导后软骨细胞ⅱ型胶原表达的影响

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1、中华中医药学会风湿病分会2010年学术会论文集一实验研究·9l·痛痹颗粒冲剂对IL．1a诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响江苏省中医院(南京210029)纪伟谈文峰陆燕卢俊青提要目的：运用中医补肾活血治疗理论，撂讨痛痨颗粒冲弃1对ILla诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原mR_NA和Ⅱ型胶原蛋白表达的影响。方法：通过RT-PCR争免疫组化法分另q检测痛痹颗粒冲剂对Ⅱ，18诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及mRNA表达的影响。结果：痛痹颗粒冲剂中大剂量组能增加IL-la诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白的表达，与模型姐相比有显著差异，特别是大剂量组

2、其Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白的表达接近正常组。结论：中药痛痹颗粒冲荆能够促进软骨基质胶原和蛋白多糖的合成，并可能抑制软骨基质胶原和蛋白多糖的降解，这可能是其软骨保护机制之一。主题词瘸痹颗粒冲帮软骨细胞Ⅱ型歉原表达实验研究骨关节炎(osteoarthrifis，OA)是一种常见的退行性骨关节疾病，随着人口结构的改变和预期寿命的延长，OA已成为全球广泛关注的社会卫生问题。实验研究表明，补肾活血方能促进软骨细胞增殖，调控软骨细胞凋亡，明显修复或延缓骨关节炎关节软骨病损。但其对OA软骨的保护作用的机制研究比较少见。本研究旨在探测补肾活血方痛

3、痹颗粒冲剂对IL—la诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原基因转录及蛋白表达的影响，从而阐明其保护作用的可能机制。1实验材料及方法1．1细胞株原代软骨细胞1．2实验用药中药生药液的制备：痛痹颗粒冲剂1付，按原剂量配比，加超纯水煎煮浓缩至lg·IIlI一浓度的中药液，3000r离心10min。取上清液，高压灭菌，调PH值至7．0，再到超净工作台用微孔滤膜过滤，得无菌生药液。1．3试剂兔抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、兔IgG二抗SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。Biosouree特级胎牛血清(美国Biosouree公司，Lot．S04716S

4、1810)，IL—l仅(美国Biodesign公司，Lot．A522mn)，1I型胶原抗体(美国Calbiochem公司，Lot．234187)，Dulbeeo’smedificalEaglemedium(美国Invitrgen公司，LOt．1459071)，琼脂糖(美国Bi-toch公司，Lot．0629s05)，DEPC(美国BioBasic公司)，TRizol(美国Invitrgen公司，Lot．2433901)，氯仿(上海生物工程公司，Lot．0201805)，异丙醇(上海生物工程公司，Lot．0405s05)，MMLAV第一链

5、eDNA合成试剂盒(上海生物工程公司，Lot。SK2027)。PCR扩增试剂盒(上海生物工程公司，Lot．SK2491)等。1．4实验仪器全自动核彩蛋白分析仪(Beck-man)，化学发光凝胶成像系统(BioRad)，电泳仪(BioRad)，梯度PCR仪(BioRad)，低温高速离心机(Eppendrof)，生物安全柜(Bake)，二氧化碳孵箱(Therlno)，超纯水仪(MiUipore)等。1．5细胞培养取自我院骨科膝关节置换(6位)的正常软骨，培养的第3,4代软骨细胞，以2×106的密度接种于24孔培养板，每组设3个复孔，在DME

6、M培养液中，内加15％特级胎牛血清，青霉素100p,·Inl。1及链酶素100ul山·rill～，在5％C02孵箱培养，每3日换液一次。1．6实验分组A组(模型组)：2ngl山·mlq也-la，B组(小剂量组)：痛痹颗粒冲剂10rag·IIll．1组+2ng·山“lL．1俚，C组(中剂量组)：痛痹颗粒冲剂50rag·IIll叫组+2ng·出～IL-la，D组(大剂量组)：痛痹颗粒冲剂100rag·ml卅组+2ng·一一IL．1aE组(正常组)：不加任何药物。1．7给药方法细胞70％融合后，换成无血清培养液体，将上述各组药物分别加入各孔中

7、，每孔200出。37qC，5％C02条件下培养48小时。1．8RT-PCR检测软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达1．8．1用TRIzol法抽提细胞总RNA，甲酰胺变性琼脂糖电泳检测纯度和完整性取lug总RNA逆转录成eDNA。将制备好的eDNA用Ⅱ型胶原基因引物扩增10个循环后加入内参甘油醛-3国车酸脱氢酶(dye．eraldehyde一3一phosphatedehydrogenase，GAPDH)的引物同时扩增。GAPDH及CollagentypeII引物由上海生工生物工程公司合成。182CollagentypeII上游⋯物5’一CATCA

8、TTCACATTCCACCCA-3’；下游；I物：3’-TffrCCG代cmGATTGACCAC-3’，扩增片段长度406hp。GAPDIt上游引物：5’-CCCAc^TCGcTcAGACAC-3’；下游引