抑制多聚糖生物合成诱导UPR对细胞的保护作用

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1、电子科技大学UNIVERSITYOFELECTRONICSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINA硕士学位论文MASTERTHESIS论文题目抑制多聚糖生物合成诱导UPR对细胞的保护作用学科专业生物化学与分子生物学学号201521210109作者姓名肖婷指导教师张丰雪教授分类号密级注1UDC学位论文抑制多聚糖生物合成诱导UPR对细胞的保护作用肖婷指导教师张丰雪教授电子科技大学成都（姓名、职称、单位名称）申请学位级别硕士学科专业生物化学与分子生物学提交论文日期2018.03.15论文答辩日期2018.06.15学位授予单位和日期电子科

2、技大学2018年06月答辩委员会主席评阅人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。InhibitionoftheBiosynthesisofOligosaccharidesPreventscelldeaththroughtheintroductionofUPRAMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaDiscipline:BiochemistryandMolecularBiologyAuthor:TingXiaoSupervisor:Dr.

3、FengxueZhangSchool:SchoolofMedicine摘要摘要细胞死亡是一个重要的生命过程，在整个机体的生长和发育中起到了基础性的作用。细胞死亡可能是细胞衰老死亡并被新细胞所替代的自然过程，也可能是由许多疾病，局部损伤或细胞所属的生物体的死亡等因素造成的。临床上，许多高危疾病的发生发展都与细胞死亡有关，器官的衰竭死亡往往是由于大面积的细胞死亡造成的，比如心肌梗死、肾衰竭等等。目前尚没有任何手段可以在临床上防止细胞大面积死亡。最近有研究显示内质网变性蛋白反应的活化与心肌保护有关。在此，我们创造性地提出一个心肌细胞防护的全新机制，即

4、通过抑制多聚糖生物合成及随后的N-联糖基化，来激活变性蛋白反应并诱导Grp94和Grp78的表达来保护细胞，抑制死亡。本论文研究目的是证明通过抑制多聚糖生物合成及细胞表面蛋白的N-联糖基化，在内质网中诱导保护性的变性蛋白反应来抑制细胞死亡，保护细胞的全新机制。首先，证明抑制多聚糖生物合成可以保护心肌细胞、抑制死亡。实验用HSP90抑制剂17-AAG(2μg/ml)给药NRK、H9C2细胞16h诱导细胞的凋亡模型，用TNFα(20ng/ml)+z.vad.fmk(30μM)给药NRK、H9C2细胞40h诱导细胞坏死的模型。同时分别用多聚糖生物合成

5、的抑制剂葡萄糖胺(5mM)、2-脱氧-葡萄糖(1mM)、衣霉素(0.5μg/ml)、2-氟脱氧-葡萄糖(1mM)干预诱导凋亡坏死的细胞模型组。使用倒置显微镜拍照记录，LDH检测细胞毒性以及用WesternBlot检测相关凋亡坏死标志蛋白caspase-3的活化，PARP的切割，RIP、MLKL的磷酸化水平等，发现多聚糖生物合成的抑制剂对诱导凋亡坏死的细胞有很明显的保护作用。其次，证明抑制多聚糖生物合成的细胞保护作用是通过激活变性蛋白反应并诱导内质网伴侣蛋白的表达实现的。分别用多聚糖生物合成抑制剂给药NRK、H9C2细胞，将采用磷酸化特异的Wes

6、ternblot来证明变形蛋白反应相关因子如ATF6、PERK及Ire1的激活以及Grp94和Grp78的表达。为了进一步证明抑制多聚糖生物合成的保护作用是通过变性蛋白反应的激活，我们将用ATF6的特异抑制剂AEBSF，PERK的特异性抑制剂GSK2606414，Ire1的特异性抑制剂4μ8c等方法阻断变性蛋白反应的激活以及Grp94和Grp78的表达。结果显示抑制多聚糖生物合成将激活变性蛋白反应的所有三个因子ATF6、PERK及Ire1；用AEBSF、GSK2606414、4μ8c抑制ATF6、PERK及Ire1的活化，会抑制多聚糖生物合成抑

7、制剂诱导的Grp94和Grp78的表达，并减弱其保护作用。通过这些实验，我们得出结论葡萄糖的保护作用是通过诱导内质网内保护性I摘要的变性蛋白反应来实现的。关键词：N-糖基化，变性蛋白反应，细胞凋亡，细胞坏死，细胞保护IIABSTRACTABSTRACTCelldeathisanimportantlifeprocessandistheeventthatthecreatureceasestoplayitsfunction.Thismaybetheresultofanaturalprocessinwhicholdcellsdieandarerepla

8、cedbynewcells,ormaybecausedbyfactorssuchasdisease,localdamage,orthedeathofa