长链非编码RNA H19在膀胱癌细胞中作为ceRNA拮抗let-7d促进肿瘤发生的分子机制研究

《长链非编码RNA H19在膀胱癌细胞中作为ceRNA拮抗let-7d促进肿瘤发生的分子机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：R737.14单位代码：10159密级：公开学号：201520266硕士学位论文中文题目：长链非编码RNAH19在膀胱癌细胞中作为ceRNA拮抗let-7d促进肿瘤发生的分子机制研究英文题目：LongNon-codingRNAH19asaceRNAantagonisttolet-7dinbladderCancercellsanditsMolecularMechanism论文作者：宁伯彬指导教师：都书琪教授学科专业：泌尿外科完成时间：2018年2月 中国医科大学硕士学位论文中国医科大学硕士学位论文长链非编码RNAH19在膀胱癌细胞中作为ceRNA拮抗let-7d促进肿瘤发生的分子机制研究LongNon-codingRNAH19asaceRNAantagonisttolet-7dinbladderCancercellsanditsMolecularMechanism论文作者宁伯彬指导教师都书琪教授申请学位医学硕士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科外科学研究方向泌尿外科学论文起止时间2015年10月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年2月 中国医科大学硕士学位论文中国医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果，论文中除加以标注的内容外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均已在文中进行了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：年月日中国医科大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密（），在年后解密适用本授权书。（保密：请在括号内划“√”）论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 中国医科大学硕士学位论文摘要目的：探究LncRNAH19作为ceRNA通过拮抗let-7d调控靶基因Lin28bmRNA表达，以促进膀胱癌细胞的增殖和转移作用。获得LncRNAH19作为let-7d的调控靶基因及相关信号传导通路的可靠证据，意在阐明LncRNAH19的功能，揭示膀胱癌发生增殖及侵袭转移的新分子机制，为寻找膀胱癌诊断和治疗的靶基因和药物提供进一步的科学依据。研究方法：通过GEO数据库中的芯片数据分析，选取我们要进行研究的目的基因。在2015年7月至2016年7月就诊就中国医科大学附属第一医院泌尿外科，并接受手术治疗的膀胱癌患者组织中抽取35例膀胱癌患者临床标本组织及其相应临近部位的正常组织，通过病理组织认证，同时伴有详细的相关临床病例资料。对于抽取的35对标本进行qRT-PCR（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction）实验验证，确定H19和Lin28b为研究对象;并通过进一步的qRT-PCR实验和统计学计算，推测H19与Lin28b在人膀胱癌组织中表达量的相关性分析。接着我们选取了本实验室现有的4种膀胱癌细胞系及1种正常的膀胱细胞系，测量每种细胞系中H19的表达量。接着通过脂质体Lipo3000转染人工合成的H19SiRNA于膀胱癌细胞T24中，验证3条不同SiRNA中效能最好的一条。通过脂质体Lipo3000转染人工合成的H19SiRNA，转染至膀胱癌细胞T24内，并以Negativecontrol（NC）作为对照，通过qRT-PCR实验对比两组实验组中H19，Lin28b及Let-7d的表达量，验证H19与Lin28b之间通过Let-7d进行调控的相互关系，以及通过CCK8实验和平板克隆实验验证其对膀胱癌细胞增殖的影响，通过划痕实验和侵袭实验验证其对膀胱癌细胞侵袭的影响。通过生物信息学网站（TargetScan）预测H19和Lin28b与let-7d的结合位点，并通过已发表的相关文献进行了进一步的验证。在体外膀胱癌细胞中，利用qRT-PCR和细胞功能实验验证H19、Lin28b与let-7d的互相调控关系以及对膀胱癌细胞的影响：通过脂质体Lipo3000转染人工合成的H19的SiRNA及Let-7d的inhibitor，转染至膀胱癌细胞5637内，并以只转染了H19SiRNA的5637膀胱癌细胞作为对照，通过qRT-PCR实验对比两组实验组中H19，Lin28b及Let-7d的表达量，验证H19与Lin28b之间通过Let-7d进行调控的相互关系，以及通过CCK8实验和平板克隆实验验证其对膀胱癌细胞增殖的影响，通过划痕实验和侵袭实验验证其对膀胱癌I 中国医科大学硕士学位论文细胞侵袭的影响。最后通过WesternBlot测定H19可以体外细胞水平中调节Lin28b蛋白质及所在通路c-Myc/Lin28b/Hmga2各个蛋白质表达量的变化。结果：通过采集的患者标本进行了qRT-PCR实验，我们发现与癌旁组织或正常膀胱组织相比，H19与Lin28b在mRNA水平上其膀胱癌组织中的表达量明显升高。此外，在膀胱癌细胞中也同样观察到增强的H19及Lin28b的表达，验证了GEO及R2两个数据库中提示H19及Lin28b在膀胱癌中高表达的正确性。接着我们通过统计学分析得出H19与Lin28b在膀胱癌的表达呈正相关性。接着我们通过相向细胞中转染H19SiRNA筛选出效能最好的SiRNA；并在体外细胞实验中通过qRT-PCR实验从mRNA水平验证了H19能够正向调控Lin28b的表达。此外，利用H19SiRNA干扰膀胱癌细胞内H19表达对比与NC组的膀胱癌细胞，利用CCK8实验验证降低H19在细胞中的表达可以降低膀胱癌细胞的增殖；利用划痕及transwell实验证明降低H19在膀胱癌细胞中的表达能够降低膀胱细胞的迁移。利用生物信息学预测得到了H19/Lin28b与Let-7d的确切的结合位点，并通过已有的文献验证该位点真实性及作用的可靠性。接着我们在膀胱癌细胞中通过qRT-PCR及细胞功能实验验证三者之间的调控关系：干扰LncRNAH19的表达能够降低靶基因Lin28bmRNA的表达；而当同时加入Let-7d的inhibitor的时候，能够减弱H19与Lin28b的协同表达。细胞功能实验结果显示：当我们在5637中转染Let-7dinhibitor及H19SiRNA并以只转入H19SiRNA作为对照时，CCK8细胞增殖实验及平板克隆实验显示膀胱癌细胞的增殖速度明显上升，Transwell实验及划痕实验都显示膀胱癌细胞的侵袭能力明显上升。最后我们通过Western印迹分析进一步发现，H19抑制Lin28b蛋白水平的表达，降低c-Myc/Lin28b/HMGA2蛋白表达，这些影响可能会导致膀胱癌细胞的异常增殖和转移。结论：1）LncRNAH19和Lin28b在膀胱癌组织中高表达且两者表达存在正相关；2）LncRNAH19以ceRNA角色构成H19/Let-7d/Lin28b网络结构，通过与Lin28b-b的mRNA竞争性的结合let-7d来调节Lin28b-b的表达，从而促进膀胱癌细胞的增殖和转移。II 中国医科大学硕士学位论文3）在膀胱癌中H19通过c-Myc/Lin28b/HMGA2信号通路参与调控。cMyc/Lin28b/HMGA2通路可以介导膀胱癌细胞的增殖和转移，且Lin28b是长链非编码RNAH19的作用靶标。关键词：长链非编码RNAH19，ceRNA，膀胱癌III 中国医科大学硕士学位论文AbstractObjective:ToexploretheroleofLncRNAH19asceRNAinpromotingtheproliferationandmetastasisofbladdercancercellsbyantagonizingtheexpressionofLin28bmRNA,atargetgeneregulatedbylet-7d.ThereliableevidenceofLncRNAH19asatargetgeneandrelatedsignaltransductionpathwayoflet-7dwasobtainedtoelucidatethefunctionofLncRNAH19andtorevealthenewmolecularmechanismofproliferation,invasionandmetastasisofbladdercancer.Toprovidefurtherscientificbasisforsearchingtargetgenesanddrugsforthediagnosisandtreatmentofbladdercancer.Methods:ThroughthechipdataanalysisinGEOdatabase,weselectthetargetgenethatwewanttostudy.FromJuly2015toJuly2016,35patientswithbladdercancerwerecollectedfromurologydepartmentofthefirstaffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversityandreceivedsurgicaltreatment.Theclinicalspecimensof35patientswithbladdercancerandtheiradjacentnormaltissueswerecollected.Certifiedbypathologicaltissue,accompaniedbydetailedclinicaldata.TheqRT-PCR(Quantitativereal-timepolymerasechainreactionationwasperformedon35samples,andH19andLin28bwereselectedastheresearchobjects,andthecorrelationbetweenH19andLin28bexpressioninhumanbladdercancerwasdeducedbyfurtherqRT-PCRexperimentandstatisticalcalculation.Thenweselected4bladdercancercelllinesand1normalbladdercelllinestomeasuretheexpressionofH19ineachcellline.ThentransfectionofH19SiRNAbytransfectionofliposomeLipo3000toT24ofbladdercancercellsprovedthebestoneof3differentSiRNA.ThesyntheticH19siRNAsweretransfectedintobladdercancercellT24byliposomeLipo3000,andNegativecontrolNCwasusedascontrol.TheexpressionofH19,Lin28bandLet-7dinthetwoexperimentalgroupswascomparedbyqRT-PCRexperiment,andtherelationshipbetweenH19andLin28bwasverifiedbyLet-7d.TheeffectonbladdercancercellproliferationwasverifiedbyCCK8assayandplatecloningassay,andtheeffectonbladdercancercellinvasionwasverifiedbyscratchtestandinvasiontest.ThebindingsitesofH19andLin28btolet-7dwerepredictedbythebioinformaticswebsiteTargetScan.andfurtherverifiedbythepublishedIV 中国医科大学硕士学位论文literature.Invitro,qRT-PCRandcellfunctionexperimentswereusedtoverifytherelationshipbetweenH19OLin28bandlet-7danditseffectonbladdercancercells:transfectionofsyntheticH19SiRNAandLet-7dinhibitorbyliposomeLipo3000wascarriedoutintobladdercancercellline5637.Using5637bladdercancercellstransfectedonlywithH19SiRNAascontrolgroup,theexpressionofH19SiRNALin28bandLet-7dintwoexperimentalgroupswerecomparedbyqRT-PCRexperimenttoverifytherelationshipbetweenH19andLin28bviaLet-7d.TheeffectonbladdercancercellproliferationwasverifiedbyCCK8assayandplatecloningassay,andtheeffectonbladdercancercellinvasionwasverifiedbyscratchtestandinvasiontest.Finally,WesternBlotwasusedtodeterminetheexpressionofLin28bproteinanditspathwayc-Myc/Lin28b/HMGA2invitro.Results:ByqRT-PCRtest,wefoundthattheexpressionofH19andLin28binbladdercancerwassignificantlyhigherthanthatinparacanceroustissuesornormalbladdertissuesatthemRNAlevel.Inaddition,theenhancedexpressionofH19andLin28bwasalsoobservedinbladdercancercells,whichconfirmedthecorrectnessofthehighexpressionofH19andLin28binbladdercancer.ThenwefoundapositivecorrelationbetweenH19andLin28bexpressioninbladdercancerbystatisticalanalysis.ThenwescreenedoutthemostefficientsiRNAsbytransfectingH19SiRNAintothecellsinvitro,andconfirmedthatH19couldpositivelyregulatetheexpressionofLin28bfromthemRNAlevelthroughqRT-PCRexperimentsinvitro.Inaddition,H19SiRNAwasusedtointerferetheexpressionofH19inbladdercancercellscomparedwiththatinNCgroup.CCK8assaywasusedtodemonstratethatdecreasingtheexpressionofH19inbladdercancercellscouldreducetheproliferationofbladdercancercells.TheresultsofscratchandtranswellshowedthatdecreasingtheexpressionofH19inbladdercancercellscouldreducethemigrationofbladdercells.TheexactbindingsitebetweenH19/Lin28bandLet-7dwasobtainedbybioinformaticsprediction.ThenwedemonstratedtheregulatoryrelationshipbetweenqRT-PCRandcellfunctionexperimentsinbladdercancercells:interferingwiththeexpressionofLncRNAH19decreasedtheexpressionoftargetgeneLin28bmRNA,andwhentheinhibitorwasaddedwithLet-7d,Theco-expressionofH19andLin28bcouldbeattenuated.TheresultsofcellfunctiontestV 中国医科大学硕士学位论文showedthatwhenwetransfectedLet-7dinhibitorandH19SiRNAin5637andtransferredintoH19SiRNAonlyascontrol,theproliferationofCCK8cellsandtheplatecloneassayshowedthattheproliferationrateofbladdercancercellsincreasedsignificantly;and.Scratchtestshowedthattheinvasiveabilityofbladdercancercellswassignificantlyincreased.Finally,wefurtherfoundthatH19inhibitedtheexpressionofLin28bproteinandreducedtheexpressionofc-Myc/Linb/HMGA2proteinbyWesternblotanalysis.Theseeffectsmayleadtoabnormalproliferationandmetastasisofbladdercancercells.Conclusion:1)LncRNAH19andLin28bwerehighlyexpressedinbladdercancertissuesandtheexpressionofH19andLin28bwerepositivelycorrelated.2)LncRNAH19actsasceRNAtoformH19/Let-7d/Lin28bnetworkstructure,whichregulatestheexpressionofLin28b-bthroughthecompetitivebindingoflet-7dwithmRNAofLin28b-b,thuspromotingtheproliferationandmetastasisofbladdercancercells.3)Inbladdercancer,H19participatesintheregulationofproliferationandmetastasisofbladdercancercellsthroughc-Myc/Lin28b/HMGA2signalingpathway,andLin28bisthetargetoflongchainnoncodingRNAH19.KeyWords:Longnon-codingRNAH19cRNAs,bladdercancerVI 中国医科大学硕士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称miRNAMicroRNA微小RNAmRNAMessengerRNA信使RNAsiRNASmallinterferingRNA小干扰RNAqRT-PCRQuantitativeReal-timePCR实时荧光定量PCRBSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白FBSFetalbovineserum胎牛血清PBSphosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸DAPI4,,6-diamidino-2-pheny1indo14',6-二脒基-2-苯吲哚DMSODimethylsulfoxide二甲基甲砜DNADeoxyribosenucleicacid脱氧核糖核酸LncRNALongnon-codingRNA长链非编码RNAODOpticalDensity吸光度值PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PMSFPhenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物RNARibonucleicacid核糖核酸VII 中国医科大学硕士学位论文RTReverseTranscription逆转录SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠SEM.StandardErrorofarithmeticmean标准误CCK8CellCountingKit-8CountingKit-8细胞活性检测试剂盒VIII 中国医科大学硕士学位论文目录中文摘要...........................................................ⅠAbstract............................................................Ⅲ英文略缩语.........................................................Ⅵ第一部分H19调节Lin28b促进胱癌增殖、侵袭作用的研究1前言..............................................................12材料与方法........................................................32.1标本............................................................................................................................................32.2细胞株........................................................................................................................................32.3主要试剂及溶液配制.................................................................................................................32.4实验仪器....................................................................................................................................42.5细胞培养，传代和冻存.............................................................................................................42.6细胞增殖实验.............................................................................................................................52.7实时定量PCR............................................................................................................................52.8细胞转染siRNA/agomir/antagomir...........................................................................................82.9Transwell细胞迁移侵袭实验.....................................................................................................82.10WesternBlot...............................................................................................................................92.11靶基因的生物信息学预测、分析.........................................................................................102.12统计学分析...........................................................................................................................103实验结果.........................................................113.1H19与Lin28b在mRNA水平上其膀胱癌组织中的表达量明显升高................................113.2膀胱癌细胞中也同样观察到增强的H19及Lin28b的表达................................................113.3H19与Lin28b在膀胱癌的表达呈正相关性.........................................................................123.4H19SiRNA筛选......................................................................................................................133.5H19能够正向调控Lin28b的表达.........................................................................................143.6降低H19在细胞中的表达可以降低膀胱癌细胞的增殖.....................................................153.7降低H19在膀胱癌细胞中的表达能够降低膀胱细胞的迁移.............................................173.8qRT-PCR，WB及细胞功能实验验证三者之间的调控关系................................................184讨论.............................................................195本研究创新性的自我评价...........................................21IX 中国医科大学硕士学位论文6参考文献.........................................................22第二部分附录综述...............................................................25参考文献...........................................................30致谢...............................................................34个人简历...........................................................35X 中国医科大学硕士学位论文第一部分：H19调节Lin28b促进胱癌增殖、侵袭作用的研究1前言膀胱癌是危害人类生命和健康最常见的泌尿系恶性肿瘤，每年约有44万的新增病例，其发病率位于恶性肿瘤的第九位。根据2015年国家癌症中心的统计数据显示，我国膀胱癌总体发病率为8.05/10万，病死率为3.29/10万，同时也是男性泌尿系肿瘤发病的首要原因。尽管有先进的手术和化学治疗技术被广泛应用，当前我国膀胱癌的发病率和死亡率仍呈上升的趋势，严重危害我国人民的健康和生命。虽然发现吸烟和职业因素（如接触芳香胺类化学物质）为较明确的两大致病因素，但其病因和具体的致癌机理仍不明确。因此发现膀胱癌进展过程中的关键分子和调节通路是膀胱癌的研究重点，有助于指导膀胱癌早期诊断到晚期综合治疗，从而降低病死率及改善预后。长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度大约在200~100000个核苷酸，没有开放阅读框，不翻译蛋白质的具有特殊功能性的RNA分子。随着近年来对于LncRNA研究的深入，越来越多的证据表明它在生命体中发挥着重要功能，参与生命活动的整个过程。LncRNA主要依靠其二级结构，与蛋白质结合，可引起染色质重构、影响转录因子功能等。另外，还可以在其线性水平与miRNA结合，间接影响mRNA表达，也可以直接与mRNA结合，影响mRNA翻译、剪切、降解过程。这些功能使其在各种疾病和肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用，其中部分LncRNA在肿瘤中甚至可直接作为抑癌或致癌基因。大量的研究表明LncRNAH19在表观遗传学水平，以及转录调控及转录后调控水平上的异常表现，对于分子生物学水平上阐明肿瘤发生、发展的每个阶段具有重要的作用。然而，H19-miRNA调控网络、H19调控细胞蛋白翻译过程的具体机制等仍然有待进一步深入的研究。MicroRNA（miRNA）是一种高度保守的非编码RNA，主要通过与靶基因mRNA完全或不完全的互补结合，导致mRNA降解或抑制翻译，调控靶基因的表达。Let-7d1 中国医科大学硕士学位论文家族是由已发现的12个let-7d编码基因转录加工产生的9种成熟的Let-7dmiRNAs（let-a,let-b,let-7c,let-7d,let-7f,let-7g,let-7i,miR-98）组成。研究表明Let-7d家族在调控干细胞分化，调节发育，抑制肿瘤发展的生物学功能中发挥重要的功能，例如调节细胞周期，诱导凋亡，抑制表观遗传的修饰和转移。最近的研究发现，Lin28b/let-7d/c-Myc通路在非浸润型膀胱癌的发生及发展过程中发挥着重要的作用；同时Let-7d的表达水平与癌细胞的分化程度密切相关。ceRNA假说描绘了编码RNA与非编码RNA之间所形成的巨大的调节基因的网络结构，同时也证明了蛋白质编码基因不需要转录翻译成蛋白质，在其转录后RNA水平就可以发挥生物学功能。对于ceRNA假说而言，miRNA和MRE是两个关键的因素。miRNA不仅能够与mRNA的MRE部分相结合，同时还要能够与lncRNA相结合，并能够在转录后水平影响靶基因的表达。ceRNA概念最早的提出可以追溯到2007年，Ebert提出了一系列的微小RNA反应元件（MREs），通过竞争性结合特殊的miRNA并降低其与原有的靶基因之间的相互作用关系。2010年，Arvey进一步解释了该假说的作用方式。2011年，Pandolfi研究组完善了该假说，在巨大复杂的调节网络中，一系列内源性RNA（mRNA，假转录本，长链非编码RNA），并非外源性miRNA海绵，可能通过不同的MREs去竞争性地结合不同的能够沉默靶基因的miRNA。大量的研究证明，LncRNAH19可能作为ceRNA参与胃癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌等肿瘤发生和进展。然而，迄今在膀胱癌中H19/let-7d/Lin28b轴还没有相关的实验报道。我们假设H19通过MRE竞争性结合Let-7d以减轻其对靶基因Lin28b的抑制，且调节c-Myc/Lin28b/Hmga2通路，促进膀胱癌的增殖和转移。在本研究中，我们提出H19作为ceRNA促进膀胱癌增殖和转移的证据，并有可能作为膀胱癌患者重要的临床标志和治疗靶点。2 中国医科大学硕士学位论文2材料与方法2.1临床标本本研究从中华医科大学第一附属医院泌尿外科收治的35例膀胱癌患者中，经病理证实，术后迅速置于液氮中，长期保存在-80°的液氮中。癌症委员会的TNM分期系统。临床病理数据的细节见表。2.2细胞株从中国科学院上海生命科学研究所获得膀胱癌细胞系5637、J82、BIU、T24和正常膀胱细胞系SV。所有细胞均在含10%胎牛血清的1649培养基中，在5%CO2浓度、饱和湿度、恒温37℃条件下培养。2.3主要试剂及溶液配制2.3.1主要试剂RNeasy/miRNeasyMiniKit（QIAGEN）RNART-PCRPremixkit（TakaraRR036A）SmallRNART-PCRPremixkit（TakaraRR716）SYBRPrimescriptRT-PCRkit（TakaraRR420）DualLuciferaseReporterAssayKit（美国Promega公司）AKT3、GAPDH、U6、miR-150q-PCR引物（上海生工生物公司）；AKT3-SiRNA、miR-150激动剂(agomir)、抑制剂（antagomir）或阴性对照（苏州吉玛公司）Lipo3000（invitrogen）CCK8试剂盒（日本同仁生物公司）Tranwell板及其他贴壁细胞培养板（美国Corning）Matrigel（美国BD公司）BCA蛋白浓度测定试剂盒（Wlaterson生物技术公司）组织细胞裂解液（RIPA）（Wlaterson生物技术公司）蛋白酶抑制复合物（Wlaterson生物技术公司）预染蛋白Marker（Thermo公司）3 中国医科大学硕士学位论文PVDF膜（AMRESCO公司）封闭液：10%脱脂奶粉（完达山）预制胶（南京金斯瑞生物公司）10×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液（凯基KGP103）10×电转移缓冲液（凯基KGP102）2.3.2溶液配制兔抗人c-Myc抗体（Abcam）；westernblot一抗稀释比1：1000兔抗人Lin28b抗体（cellsignaling）；westernblot一抗稀释比1：1000兔抗人Hmga2抗体（cellsignaling）；westernblot一抗稀释比1：1000鼠抗人β-actin抗体（sigma）；westernblot一抗稀释比1：5000山羊抗兔抗体（zsbio）；二抗稀释比1：2000山羊抗鼠抗体（zsbio）；二抗稀释比1：20002.4实验仪器LC480实时定量PCR仪（美国罗氏公司）2K15C型低温超速离心机（美国Sigma公司）台式高速离心机（湖南湘雅仪器仪表总厂）ChemiImager5500电泳凝胶成像系统（美国Alpha公司）DIAX900型匀浆机（德国Heidolph公司）普通光学显微镜（日本Olympus公司）电泳槽及垂直电泳系统（美国Bio-rad公司）半干电转移仪（美国Bio-rad公司）紫外分光光度计（美国Thermo公司）细胞CO2培养箱(Thermo公司)净水仪(美国miliporeElix公司)酶联免疫检测仪(美国Bio-rad公司)微量移液器（美国Thermo公司）4 中国医科大学硕士学位论文2.5实验仪器细胞培养，传代和冻存2.5.1细胞培养在4℃环境中保存人膀胱癌细胞系5637T24BIUJ82SV及1640基本培养基、胎牛血清(FBS)和0.25%胰蛋白酶。1)在无菌环境中，将900ml的碱性培养基与100ml的胎牛血清混合，形成含10%胎牛血清的1640细胞培养基。2)将细胞在含10%胎牛血清的1640培养基上培养。3)在37℃恒温培养箱中培养细胞。2.5.2细胞复苏制备方法：用75%乙醇棉球擦拭超净台面，紫外线照射15分钟，加入10%胎牛血清1640培养基，预先从冰箱中提取胰蛋白酶pbs缓冲液，恒温水浴预热至37℃使用，将含细胞的冷冻管于-130℃从冰箱中取出，立即放入37℃恒温水浴箱中快速融化。将融化的冷冻保存管喷上75%的酒精，将1ml加入到超洁净台上，转至中心离心机，离心：1000rpm，3min，离心后丢弃上清液，1mlpbs缓冲液加入悬浮细胞3min，丢弃上清液后，将上清液加入1mlrpmi1640培养基中，在离心管中重悬浮细胞中加入1mlrpmi1640培养基，再加入悬浮液。将细胞培养瓶中标有细胞名、人培养和培养日期的细胞培养瓶，转入37℃孵化器，观察第二天细胞生长状况，更换培养基一次，取出悬浮死亡细胞，继续培养。2.5.3细胞传代细胞培养时应每日观察细胞状态，当培养液中的细胞覆盖率达到80%左右时，需进行继代培养。术前准备，用1×PBS将原培养液丢弃冲洗两次，再加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，转至恒温孵化器消化20~8min(根据不同类型的膀胱癌细胞而定)。---显微镜下观察细胞形态，加入1mlRPMI1640培养基，终止消化率，用液体转移枪将贴壁细胞吹起，混合成细胞悬液，将细胞悬液从一半转移至1/4。加入3~5mlRPMI1640培养基，将培养瓶转入孵化器。2.5.4细胞冻存5 中国医科大学硕士学位论文显微镜观察待冻细胞(细胞无微生物污染，对数生长期，盖度大于80%)，按需配制90%DMSO10%牛血清细胞冷冻液，用PBS缓冲液冲洗原培养液，加入1m10.25%胰蛋白酶(覆盖整个平底)，停留3分钟，显微镜下观察细胞形态，观察细胞形态。细胞悬液用15毫升离心管收集，离心3分钟，取上清液，用一次性取液器吸收细胞冷冻液，放入离心管内，将液体吹入离心管内，将细胞悬液吹入离心管，离心3分钟。移转装置混合，形成细胞悬液。混合细胞悬浮液转移到冷冻管(0.8毫升/管)，标明细胞的名称、冷冻日期等。将冷冻管放在一个缓慢的冷冻箱中，隔夜放置在液氮中，第二天储存在受孕者体内。你需要每天观察细胞的生长情况，等待细胞被覆盖。2.5.5细胞计数原培养液用PBS缓冲液洗涤，加入1m10.25%胰蛋白酶(覆盖整个瓶底)，消化20s~8min，加入1ml培养基结束消化，用液体转移枪吸收培养瓶中的培养基形成细胞悬液，进行细胞计数。根据Bio-Rad细胞计数器的指示，将10μl的细胞悬浮液从移液器取出进入细胞计数器，并对其值进行测量和记录。2.5.6转染将对数期细胞转移到六孔板上，在含10%胎牛血清的RPMIMedium1640培养基中培养，第二天观察细胞生长状况。细胞数为60%~70%。培养基被吸收，细胞用1×pbs缓冲液仔细清洗2次，避免冲出培养皿底部，粘在壁上。1mlOpti-MEMI还原血清Medium5在Opti-MEMI还原培养基中加入μ1-脂质体2000试剂，在250μlOpti-MEMi中加入miRNA样或siRNAs(最高终浓度为500nm)。将所制备的miRNA类似物或siRNA与脂质体混合，在室温下孵育20min，转染4~6h后，将转染液吸收，加入含10%胎牛血清的rPMI培养基1640中。下一次实验按实验要求在培养24h或48h后进行。筛选干扰片段2.6细胞增殖实验对数期细胞接种于96孔，每孔约含600~10000个细胞，37℃孵育12小时，此时以0代替培养基，在100μl培养基的孔内发现10个ulCCK8，37℃孵育1~4小时，吸光度为1~4小时。在OD490mm处测量，0点后分别于12：24、48、72和96小时重复上述三步。2.7实时定量PCR6 中国医科大学硕士学位论文2.7.1RNA提取（RNeasy/miRNeasyMiniKit）将5637个T24细胞或膀胱癌组织用pbs洗3次，加入700μlQIAZOL裂解液，在室温下用匀浆粉碎5min，加入140μl氯仿，在室温下剧烈搅拌15s，室温静置3min，离心15min~12000g~4℃，将0.4~0.5ml上层的吸收水加入新的收集管中，加入0.5ml。乙醇，倒置，混合。上清液离心10min~12000g/g~(4℃)，以700μl为流动相，在摇头丸柱中加入700μlRWT，柱内加入700μlRWT，离心1min，12000g/g，4℃，废液；柱内加入500μlRPE，离心1min，12000g/g，4℃，废液。收集管置于新收集管中，离心1min，离心12000g/g，离心4℃，柱置于新收集管中，加入30~50μr无酶水，离心5min，8000g/g，4℃，紫外分光光度计测定OD值和浓度，在-80℃保存总RNA。2.7.2SmallRNA逆转录反应体系参照反转录试剂盒说明书（TakaraRR716）①按下列组份配制RT反应液（TakaraRR716）。试剂使用量2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）10μl0.1%BSA2ulmiRNAPrimeScriptRTEnzymeMix2μlTotalRNA（10pg/μl~1μg/μl）1μlRNaseFreedH2OUpto20μl②反应条件如下：37℃，60min（Poly(A)加尾和反转录反应）；85℃，5sec（酶的失活反应）在100μμ1稀释剂的RT反应液中加入无RNaseH2O，在下一反应体系中进行定量检测。2.7.3TotalRNA逆转录反应体系参照反转录试剂盒说明书（TakaraRR036）①按下列组份配制RT反应液（TakaraRR036）。试剂使用量5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μlTotalRNA*7 中国医科大学硕士学位论文RNaseFreedH2OUpto10μl*反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。②反应条件如下：37℃，15min（反转录反应）；85℃，5sec（酶的失活反应）2.7.4smallRNAReal-timePCR反应①按下列组份配制PCR反应液（TakaraRR716）。试剂使用量SYBRPremixExTaqII（2×）12.5μlPCRForwardPrimer（10μM）1μlUni-miRqPCRPrimer（10μM）1μl模板（cDNA溶液）2μldH2O8.5μlTotal25μl②进行RealTimePCR反应。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃10秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃20秒③结果分析2.7.5TotalRNAReal-timeRT-PCR反应①按下列组份配制PCR反应液（RR820a）。试剂使用量SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）12.5μlPCRForwardPrimer（10μM）1μlPCRReversePrimer（10μM）1μlRT反应液（cDNA溶液））2μldH2O8.5μlTotal25μl②进行RealTimePCR反应。8 中国医科大学硕士学位论文两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30秒③结果分析2.8细胞转染选择生长状态良好，在对数期细胞转移至6孔板，含10%胎牛血清。在RPMIMedium1640培养基上过夜，观察细胞贴壁情况。细胞生长情况下，细胞数在60%~70%之间以适当的吸力抛弃培养基，用1倍PBS缓冲液仔细清洗细胞2次，避免冲至培养皿底部壁板。加入1mlOpti-MEMI后，血清Medium.5降低。1脂质体脂质体脂质体脂质体2000试剂加入250LOpti-MEMI还原血清培养基中混合，在250LOpti-MEMI还原血清培养基中加入MiRNA类似物或siRNA(终浓度为500nm)。将miRNA类似物或siRNA与脂质体混合后，在室温下培养20min，加入500l转染液，进行细胞转移，标记后转入孵化器。转染4~6h后，将转染液吸弃，将胎牛血清放入含10%RPMI介质M1640培养基的2ml中，下一次实验按实验要求训练24h或48h。2.9Transwell细胞迁移侵袭实验迁移试验是用未包被martrigel的Transwell板进行的迁移细胞迁移试验，用涂有martrigel的Transwell板进行的跨井试验是细胞侵袭试验，转染的5637/t24细胞接种在Transwell室的上腔内(约有20000个细胞接种到含有300ul10S的rpmi1640培养基中)，细胞附着后(约4-6小时)，上腔细胞接种。用含2S的RPMI1640培养基代替RPMI1640培养基，加入600μl10SRPMI1640培养基作为趋化剂。24h后，用棉签去除后，用棉签将上腔未穿透细胞染色，未清洗的PBS轻轻擦干。用100%甲醛固定30min或1%结晶紫固定15min，在奥林巴斯倒置显微镜下观察染色细胞，并在200X下拍照。2.10WesternBlot2.10.1细胞总蛋白提取、BCA法浓度测定及蛋白变性丢弃培养基后，用冷PBS洗涤细胞3次。取细胞于1.5mlEP管，离心5min，取上清液，加入200μl预冷RIPA裂解缓冲液和2μl的100mmol蛋白酶抑制剂pmsf，9 中国医科大学硕士学位论文剧烈摇动1分钟，13000r/min4℃离心20min，离心20min，测定蛋白质浓度，绘制标准曲线OD595。测定结果为线性回归方程：y=AXB。在595nm处测定了白色样品和对照样品的吸收率。将差异转化为标准曲线方程，计算出相应的蛋白质浓度。在100℃条件下，加入合适体积的5×加载缓冲液(按30μl样品量计算，每个样品在100℃下加热10min)，变性10min，冷冻至-80℃。2.10.2免疫印迹预制胶的密封条的底端取出，放入槽中，加入足够的电泳液开始样品。解冻后，样品混合40ug蛋白/通道。凝胶浓度电压为90V、凝胶分离由110V。凝胶电泳是停止时溴酚蓝电泳达到凝胶的底部。浸胶在传输解决方案的一小部分，然后将胶膜在阴极海绵纸凝胶，以PVDF膜，海绵阳极，从而去除泡沫。三明治的转移槽放置，和350mA的膜转移到膜2h在恒定压力。PVDF膜用TBST，慢慢动摇和密封在密封液（含5%脱脂奶粉）在室温下2小时，图像由ECL发光Westernblot检测成像系统采集。2.13统计学分析利用GraphPad6.0进行统计映射和独立样本t检验数据处理.采用SPSS19.0软件进行Pearson相关系数分析(P<0.05)每组重复三次以上。10 中国医科大学硕士学位论文3实验结果3.1膀胱癌LncRNA及mRNA表达测定RT-qPCR分析表明，35例膀胱癌组织中H19和Lin28b较癌旁组织明显升高。RT-qPCR结果与生物信息学预测结果一致(图1，P<0.05，n=35)。图1、应用RT-PCR检测35例未化疗膀胱癌组织中H19和Lin28b的表达。数据以平均±扫描电镜显示，n=35。统计分析表明，H19和Lin28b在膀胱癌组织中的表达明显高于癌旁非肿瘤组织。Fig.1RT-qPCRwasusedtomeasuretheexpressionofH19andLin28bin35casesofbladdercancertissueswithoutchemotherapy.Dataareshownasmean±SEM,n=35.StatisticalanalysisindicatedthatH19andLin28bexpressionwassignificantlyhigherinbladdercancertissuesthaninadjacentnon-tumortissues.3.2Pearson相关分析检测H19与Lin28b的关系Pearson相关性分析显示，H19和Lin28b的表达呈正相关（r=0.404，P<0.05，图2）。11 中国医科大学硕士学位论文图2、皮尔逊相关分析表明，H19在膀胱癌中的表达与Lin28b表达呈正相关(r=0.404)。Fig.2PearsoncorrelationanalysisshowedthatH19expressionwaspositivelyrelatedwithLin28bexpressioninbladdercancers(r=0.404).3.3RT-qPCR检测膀胱癌细胞系中H19的表达与正常膀胱细胞系SV-HUC-1相比，在四种膀胱癌细胞系中H19也显著上调（图3）。图3、检测了H19在4株膀胱癌细胞和1株正常膀胱细胞系中的表达。统计分析表明，H19在膀胱癌细胞中的表达明显高于正常膀胱细胞。12 中国医科大学硕士学位论文Fig.3TheexpressionofH19wasdeterminedinfourbladdercancercelllinesandonenormalbladdercellline.StatisticalanalysisindicatedthatH19expressionwassignificantlyhigherinbladdercancercellsthaninnormalbladdercells.3.4qRT-PCR筛选干扰片段将Si1、Si2、Si3三个RNA干扰片段转染至T24细胞，并设阴性对照。qRT-PCR分析表明，提取RNA后SI1干扰效果最好。因此，选择Si1作为干扰片段进行后续实验。图4、分析qRT-PCR，筛选出3个片段中的最佳干扰片段。用qRT-PCR方法检测转染Si1、Si2、Si3片段后，H19在膀胱癌T24细胞中的表达情况。NC代表正常对照组，Lipo3000组指仅用lipo3000处理的细胞，空白组指T24细胞未处理。Fig.4qRT-PCRanalyzedtopickedthebestinterferencefragmentamongthreefragments.TheexpressionofH19inbladdercancercellT24aftertransfectedwithsifragments(si1,si2,si3),respectively,wereanalyzedbyqRT-PCR.NCrepresentsnormalcontrolgroup，lip3000groupreferstothecellsonlytreatedwithlip3000,blankgroupmeansT24cellwithouttreated.3.5检测细胞增殖能力及运动能力为探讨H19对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，通过下调或上调H19细胞增殖曲线进行CCK-8实验，结果表明，与对照组相比，稳定的pcDNA3.1-H19细胞活性13 中国医科大学硕士学位论文显著升高，CCK8实验结果一致，而siH19组5637/T24细胞增殖受到明显抑制(图5)。图5H19调节BCC细胞的迁移和侵袭。将H19siRNA转染膀胱癌细胞，qrt-pcr检测H19表达显著降低，H19siRNA处理膀胱癌细胞，伤口愈合试验检测细胞迁移情况，结果表明：H19siRNA转染膀胱癌细胞后，细胞迁移受到明显抑制。与siRNA对照组比较，差异有显着性(P<0.05)。14 中国医科大学硕士学位论文Fig.5H19modulatedmigrationandinvasionofBCCcells.A、BladdercancercellsweretransfectedwithH19siRNA,andH19expressionweresignificantlydecreasedmeasuredbyqRT-PCR.B、BladdercancercellsweretreatedwithH19-siRNA,andcellmigrationwascheckedbywoundhealingassays,theresultsshowedthatBladdercancercellsmigrationwasremarkablyimpairedafterH19knockdown.C、BladdercancercellsinvasionwereevaluatedbyTranswellassaysaftertransfectedwithH19-siRNA,andtheresultsshowedthatcellinvasionwassignificantlydecreasedcomparedwiththesiRNAcontrol,statisticalanalysisisshowninD.*P<0.053.6共转对细胞增殖、侵袭的影响然后，通过划痕和Transwell分析发现，T24细胞表达let-7d的减少消除了对H19干扰所引起的增殖和侵袭的抑制作用(图7)。这些数据表明，H19作为天然海绵，对let-7d的吸附起着“天然海绵”的作用，而H19的致癌作用依赖于let-7d。图6。H19-siRNA诱导膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。A、用H19-siRNA和let-7d抑制剂处理膀胱癌细胞，伤口愈合试验表明，与只转染H19-sirna.B、Transwell的膀胱癌细胞相比，膀胱癌细胞的迁移得到了挽救。Transwell试验表明，两种方法均能恢复膀胱癌细胞的侵袭能力。H19-siRNA和let-7d抑制剂与只转染H19-siRNA的膀胱癌细胞比较.统计分析载于C.*P<0.05。Fig6.Downexpressionoflet-7drescuedH19-siRNAinducedinhibitionofBladdercancercellscellmigrationandinvasion.aBladdercancercellsweretreatedwithH19-siRNAandlet-7dinhibitor,thewoundhealingassaysshowedthatthemigrationofBladdercancercellscellswererescuedcomparedwithBladdercancercellscellsonlytransfectedwithH19-siRNA.bTranswellassays15 中国医科大学硕士学位论文demonstratedthattheinvasionofBladdercancercellscellswererestoredwhentreatedwithbothH19-siRNAandlet-7dinhibitorcomparedwithBladdercancercellscellsonlytransfectedwithH19-siRNA.Statisticalanalysisisshowninc.*P<0.053.7qRT-PCR分析了进一步证实H19和Let-7d之间的调控关系，首先，用qrt-PCR技术证明，在T24细胞中共转染h9siRNA和let-7抑制剂可以增加T24细胞Lin28bmRNA的表达，但H19mRNA的表达无明显变化(图二)。7)第二，与H19过表达细胞相比，H19、let-7d共转染可降低Lin28bmRNA的表达，但不能改变H19的表达。图七、用qRT-PCR法检测转染NC(对照组)、H19siRNA和H19siRNA+Let-7d抑制剂及载体pcDNA3.1、pcDNA3.1-H19和pcDNA3.1-H19+Let-7dmimics的T24细胞中H19和Lin28b的mRNA水平。Fig7.ThemRNAlevelsofH19andLin28binT24cellstransfectedwithNC(controlgroup)H19siRNAandH19siRNALet-7dinhibitorandvectorpcDNA3.1-H19andpcDNA3.1-H19Let-7dmimicsweredetectedbyqRT-PCRassay.3.8WesternBlot分析然后，我们探讨了H19是否通过调节Lin28b在体外对细胞增殖的影响。结果表明，该蛋白具有较高的侵袭性标记蛋白水平。WB显示h19可能是细胞增殖和侵袭的主要正性调节因子，当siH19片段转染细胞后，这些相关标记物的水平降低(图8)，16 中国医科大学硕士学位论文进一步证实了h19和lin28b表达的变化是一致的，更重要的是h19和lin28b的共转染模拟了h19对t24细胞的增殖和侵袭作用，而7d抑制剂的转染则明显地挽救了h19对t24细胞的增殖和侵袭作用。Si-H19对T24细胞增殖和侵袭的抑制作用。A、B、图八、A图显示通过WesternBlot结果显示，与NC组的膀胱癌细胞相比较分别在5637及T24两个细胞系中加入H19的SiRNA,c-Myc/Lin28b/HMGA2蛋白通路中蛋白质的表达量均呈明显下降；B图显示与只加入H19SiRNA的膀胱癌细胞相比，共转染SiRNA和let-7dinhibitor的lin28b17 中国医科大学硕士学位论文的蛋白表达量明显升高；而与至转入H19pcDNA的膀胱癌细胞相比，共转染pcDNA和let-7dmimics的蛋白表达水平明显下降。Figure8.AisshownthroughtheWesternBlotresult,ComparedwiththoseinNCgroup,theproteinexpressionofSiRNA-c-Myc/Linb/HMGA2proteinpathwayaddedtoH19in5637andT24celllineswassignificantlydecreasedcomparedwiththatinH19SiRNAonlycells.Theproteinexpressionoflin28bcotransfectedwithSiRNAandlet-7dinhibitorwassignificantlyhigherthanthatofbladdercancercellstransfectedwithH19pcDNA,andtheexpressionlevelofpcDNAandlet-7dmimicswassignificantlylowerthanthatofbladdercancercellstransfectedwithH19pcDNA.18 中国医科大学硕士学位论文4讨论长链非编码H19已被证明能促进膀胱癌细胞的增殖和转移。本研究首次采用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测了H19/Let-7d/Lin28b这个ceRNA轴在膀胱癌组织中的表达，并通过CCK8（CellCountingKit-8）和Westernblotting确定了H19在膀胱癌组织中调节膀胱癌细胞增殖和转移的生物学功能。lncRNA-H19，是一个母本表达和父本印记2.7kb基因，是胚胎发育和肿瘤发生的关键角色之一。最近，研究强调了H19在EMT和转移的复杂过程中的显著作用。大量的研究证实，H19在膀胱癌细胞中显著增加，并与膀胱癌的恶性程度呈高度相关。然而，不论在体内细胞实验还是体外实验H19都在膀胱癌的发生及发展过程中起到至关重要的作用。在本文中，我们揭示了H19的一个新的分子生物学功能，作为ceRNA竞争性结合内源性的Let-7d，并进一步促进Lin28b及其所在通路的蛋白质表达水平。越来越多的证据显示lncRNAs在肿瘤的发生和发展中发挥关键作用。对lncRNA表达谱进行研究可能对膀胱癌的诊断，治疗和预后具有临床价值。LncRNA可以通过多种机制执行其功能。一些报道显示lncRNA是基因表达的强大和重要的顺式或反式调节元件。LncRNA也可以通过作为前体和/或作为miRNA的“海绵”执行其功能。然而，到目前为止，很少有关于膀胱癌的lncRNAs的全基因组表达和功能分析。为了全面揭示这些潜在的分子机制及治疗靶点，对于各种类型的癌症的潜在的分子机制需要得到进一步的解释。为了证实这个想法，我们根据生物信息学预测和患者的qRT-PCR数据，证实H19在膀胱癌组织及细胞中表达上调及与Lin28b的相关性，通过体外增殖（CCK-8，细胞平板克隆实验）、细胞运动能力（划痕实验、Transwell）等一系列体内、外实验证明H19与膀胱癌的增殖、侵袭和转移相关，揭示了H19在膀胱肿瘤进展中的重要性。此外，我们通过之前的文献报道确定了验证H19与Let-7d结合，以及共转时通过CCK8、平板克隆、划痕实验、transwell、RT-qPCR、Westernblot等实验探讨H19在膀胱癌细胞侵袭、转移中作为ceRNA新的分子机制，其通过下调H19同时降低Let-7d表达，并因此在功能上消除了Let-7d对靶基因Lin28b3'UTR结合的内源抑制效应，而不对Let-7d进一步处理具有相反的作用。我们的数据表明一个新的miRNA作用机制：在膀胱癌细胞的增殖和转移的过程中与lncRNA相互作用。这种新的机制将促使更好地了解上膀胱癌细胞的增殖和转移。19 中国医科大学硕士学位论文近期，有文献已经提出了ceRNA假说，是各种RNA（包括mRNA，lncRNA，假基因和环状RNA)之间的复杂相互作用。这些RNA通过与共同结合的miRNA竞争性结合、相互联系和彼此调节而作为ceRNA发挥作用。MicroRNA（一类小的非编码RNA分子,含有约22个核苷酸）是基因表达的转录后水平的重要调节物。它可能在癌症发展和转移中起重要作用，预示着洞察RNAs之间的新的联系将更有助于对基因调控网络的理解。据报道，在胰腺癌、乳腺癌以及肌肉组织的生长发育过程中H19与miRNAlet-7d相关且调节let-7d靶基因的表达，这为H19是miRNAlet-7d的“天然海绵”提供了有力的证据。此外，基于生物信息学预测结合实验分析，H19被发现与RISC关联，并可能包含各种其他miRNA结合位点，表明H19可能调节一些其他miRNA。探索H19是否可能通过吸附其他未知的miRNA发挥其功能是非常有意义的。我们目前的研究表示lncRNAH19可能作为ceRNA通过消除Let-7d在膀胱癌进展中的作用，符合此前的报告。研究表明Lin28b在膀胱癌中呈高表达，并于膀胱癌病理分级高度相关。Lin28b的异常表达通常以多种恶性肿瘤为特征,Lin28b特别是在一些癌症包括膀胱癌中的显示高表达水平在这里，我们验证了上调H19通过竞争性结合Let-7d消除对Lin28b的抑制，增加对膀胱癌细胞的增殖和转移的作用。简而言之，我们的研究结果提供了一个新的机制，H19可能作为ceRNA通过结合调节膀胱癌的发展和进展中的增殖和转移。我们从lncRNAH19作为ceRNA的调控功能入手，从一个全新的角度深入探讨lncRNAH19的功能及其在膀胱癌中对增殖和侵袭转移的机制，揭示lncRNAH19促进膀胱癌增殖及侵袭转移的新颖机制，旨为膀胱癌诊断和治疗提供原创性的科学依据，为膀胱癌的进一步诊断，治疗和功能研究奠定基础。20 中国医科大学硕士学位论文本研究创新性的自我评价本研究直接从膀胱癌标本着手，研究了H19/Let-7d/Lin28b这个ceRNA调控网络在膀胱癌中的具体功能，与临床联系紧密。通过一系列qRT-PCR和细胞功能实验证实H19与内源性miRNALet-7d的3’UTR直接结合并能够与Let-7d的下游Lin28b发生调控关系。此外，我们巧妙地将H19与膀胱癌迁移和增殖的能力联系起来，接着我们证实了H19对c-Myc/Lin28b/HMGA2相关经典分子蛋白水平的调控作用。当然最重要的是这项研究的结果为我们寻找新的膀胱癌诊断和治疗方法提供了理论依据。21 中国医科大学硕士学位论文参考文献[1]JemalA,SiegelR,XuJ,WardE.Cancerstatistics,2010.CACancerJClin.2010.60(5):277-300.[2]BabjukM,OosterlinckW,SylvesterR,etal.EAUguidelinesonnon-muscle-invasiveurothelialcarcinomaofthebladder,the2011update.EurUrol.2011.59(6):997-1008.[3]KaufmanDS,ShipleyWU,FeldmanAS.Bladdercancer.Lancet.2009.374(9685):239-49.[4]PollardC,SmithSC,TheodorescuD.Moleculargenesisofnon-muscle-invasiveurothelialcarcinoma(NMIUC).ExpertRevMolMed.2010.12:e10.[5]WallerandH,ReiterRR,RavaudA.Moleculartargetinginthetreatmentofeitheradvancedormetastaticbladdercancerorbothaccordingtothesignallingpathways.CurrOpinUrol.2008.18(5):524-32.[6]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell.2004.116(2):281-97.[7]CalinGA,SevignaniC,DumitruCD,etal.HumanmicroRNAgenesarefrequentlylocatedatfragilesitesandgenomicregionsinvolvedincancers.ProcNatlAcadSciUSA.2004.101(9):2999-3004.[8]SuárezY,Fernández-HernandoC,YuJ,etal.Dicer-dependentendothelialmicroRNAsarenecessaryforpostnatalangiogenesis.ProcNatlAcadSciUSA.2008.105(37):14082-7.[9]DingXM.MicroRNAs:regulatorsofcancermetastasisandepithelial-mesenchymaltransition(EMT).ChinJCancer.2014.33(3):140-7.[10]RyanBM,RoblesAI,HarrisCC.GeneticvariationinmicroRNAnetworks:theimplicationsforcancerresearch.NatRevCancer.2010.10(6):389-402.[11]UenoK,HirataH,MajidS,etal.TumorsuppressormicroRNA-493decreasescellmotilityandmigrationabilityinhumanbladdercancercellsbydownregulatingRhoCandFZD4.MolCancerTher.2012.11(1):244-53.[12]FengY,KangY,HeY,etal.microRNA-99aactsasatumorsuppressorandisdown-regulatedinbladdercancer.BMCUrol.2014.14:50.[13]WangJ,ZhangX,WangL,etal.MicroRNA-214suppressesoncogenesisandexertsimpactonprognosisbytargetingPDRG1inbladdercancer.PLoSOne.2015.10(2):e0118086.[14]ZhaoX,HeW,LiJ,etal.MiRNA-125binhibitsproliferationandmigrationbytargetingSphK1inbladdercancer.AmJTranslRes.2015.7(11):2346-54.22 中国医科大学硕士学位论文[15]YuG,YaoW,XiaoW,LiH,XuH,LangB.MicroRNA-34afunctionsasananti-metastaticmicroRNAandsuppressesangiogenesisinbladdercancerbydirectlytargetingCD44.JExpClinCancerRes.2014.33:779.[16]ZhaoX,LiJ,HuangS,WanX,LuoH,WuD.MiRNA-29cregulatescellgrowthandinvasionbytargetingCDK6inbladdercancer.AmJTranslRes.2015.7(8):1382-9.[17]FengJ,YangY,ZhangP,etal.miR-150functionsasatumoursuppressorinhumancolorectalcancerbytargetingc-Myb.JCellMolMed.2014.18(10):2125-34.[18]JinM,YangZ,YeW,XuH,HuaX.MicroRNA-150predictsafavorableprognosisinpatientswithepithelialovariancancer,andinhibitscellinvasionandmetastasisbysuppressingtranscriptionalrepressorZEB1.PLoSOne.2014.9(8):e103965.[19]LiT,XieJ,ShenC,etal.miR-150-5pinhibitshepatomacellmigrationandinvasionbytargetingMMP14.PLoSOne.2014.9(12):e115577.[20]SrivastavaSK,BhardwajA,SinghS,etal.MicroRNA-150directlytargetsMUC4andsuppressesgrowthandmalignantbehaviorofpancreaticcancercells.Carcinogenesis.2011.32(12):1832-9.[21]LeiY,HuX,LiB,etal.miR-150modulatescisplatinchemosensitivityandinvasivenessofmuscle-invasivebladdercancercellsviatargetingPDCD4invitro.MedSciMonit.2014.20:1850-7.[22]CofferPJ,JinJ,WoodgettJR.ProteinkinaseB(c-Akt):amultifunctionalmediatorofphosphatidylinositol3-kinaseactivation.BiochemJ.1998.335(Pt1):1-13.[23]GonzalezE,McGrawTE.Insulin-modulatedAktsubcellularlocalizationdeterminesAktisoform-specificsignaling.ProcNatlAcadSciUSA.2009.106(17):7004-9.[24]ChenXN,WangKF,XuZQ,etal.MiR-133bregulatesbladdercancercellproliferationandapoptosisbytargetingBcl-wandAkt1.CancerCellInt.2014.14:70.[25]AttoubS,ArafatK,HammadiNK,MesterJ,GabenAM.Akt2knock-downrevealsitscontributiontohumanlungcancercellproliferation,growth,motility,invasionandendothelialcelltubeformation.SciRep.2015.5:12759.[26]FoleyNH,BrayIM,TivnanA,etal.MicroRNA-184inhibitsneuroblastomacellsurvivalthroughtargetingtheserine/threoninekinaseAKT2.MolCancer.2010.9:83.[27]LinHP,LinCY,HuoC,etal.AKT3promotesprostatecancerproliferationcellsthroughregulationofAkt,B-Raf,andTSC1/TSC2.Oncotarget.2015.6(29):27097-112.23 中国医科大学硕士学位论文[28]MureH,MatsuzakiK,KitazatoKT,etal.Akt2andAkt3playapivotalroleinmalignantgliomas.NeuroOncol.2010.12(3):221-32.[29]TengY,ZhangY,QuK,etal.MicroRNA-29B(mir-29b)regulatestheWarburgeffectinovariancancerbytargetingAKT2andAKT3.Oncotarget.2015.6(38):40799-814.[30]D'CostaJJ,GoldsmithJC,WilsonJS,BryanRT,WardDG.ASystematicReviewoftheDiagnosticandPrognosticValueofUrinaryProteinBiomarkersinUrothelialBladderCancer.BladderCancer.2016.2(3):301-317.[31]YeF,WangL,Castillo-MartinM,etal.Biomarkersforbladdercancermanagement:presentandfuture.AmJClinExpUrol.2014.2(1):1-14.[32]SunW,ZhangZ,WangJ,etal.MicroRNA-150suppressescellproliferationandmetastasisinhepatocellularcarcinomabyinhibitingtheGAB1-ERKaxis.Oncotarget.2016.7(10):11595-608.[33]ShengL,HeP,YangX,ZhouM,FengQ.miR-612negativelyregulatescolorectalcancergrowthandmetastasisbytargetingAKT2.CellDeathDis.2015.6:e1808.24 中国医科大学硕士学位论文综述H19在癌症中的研究进展20多年前，IncRNA新秀IncRNA成为有关癌症和胎儿生长的头条新闻(由于当时的技术有限)。这些IncRNA曾经被认为是细胞中的特例[1]；到2005，哺乳动物基因组计划的功能注释揭示了35000ncRNA的存在，这引起了科学家们对ncRNA的极大关注。在2010至2015年间发表的相关文章几乎呈指数增长。IncRNA作为转录体中最大的转录序列，已成为所有生命活动中最重要的一部分。长非编码RNA-IncRNAs是人类基因组中一类非蛋白质编码的转录RNA，长度超过200个核苷酸，主要依赖于其二级结构，与蛋白质结合可引起染色质重塑和转录因子功能。此外，它还能在线性水平与miRNA结合，间接影响mRNA的表达，并直接与mRNA结合，从而影响mRNA的翻译、剪切和降解过程。在肿瘤的发生和发展过程中，癌细胞获得以下生物学标记：1)持续增殖信号2)逃避生长抑制因子3)抗细胞死亡4)可无限复制5)诱导血管生成诱导侵袭转移。[2，3]和H19作为第一组成员发现，转录前、转录后、表观遗传学和其他调控阶段与癌症密切相关。[4-7]因此，研究H19的调控和表达机制具有重要的意义。本文综述了H19和H19的调控机制。1．LncRNA的发现与研究进展1、1LncRNA的发现以新DNA测序技术的发展和人类基因组计划的结束为标志，在过去十年的基因革命中，我们对癌症分子生物学的认识发生了彻底的改变。[8,9]完整的人类基因组序列为癌症易感性人群的对照及比较提供了一个完整的框架，并使得通过基因突变预测临床预后成为可能。与基因组学的研究进展相比较，转录物组学的发展揭示了许多与癌症相关的非编码基因功能位点。[10-14]大型cDNA测序项目为转录组的复杂性提供了一个前所未有的角度。[15-19]令人惊讶的是，在全基因组中80%-90%部位积极转录的情况下，只有1%-2%的基因组编码蛋白质。[15,20]而这些基因组中的非编码部分生成了大量在性质及功能等方面不同的调节RNA；并按照他们的尺寸进行了分类，例如miRNA和lncRNA(>200nt)。[1,16,21]长链非编码RNA(lncRNA)已经被证实具有在转录前、转录后或表观遗传水平调节基因表达的能力。25 中国医科大学硕士学位论文1、2LncRNA与肿瘤在过去的十年中lncRNA被认为含有以下共同的特征:(1)其自身的转录通过RNA聚合酶Ⅱ调节(2)能够像编码蛋白质的RNA一样被加帽、多聚磷腺苷酸化和剪切(3)受已知转录因素的调节(4)它们在序列水平上的保守性很差。但更值得注意的是，lncRNA在基因表达调控中的多重角色及对肿瘤发生、发展的影响。对于lncRNA的认知和描述揭示了其在肿瘤细胞生存和死亡中的分子调控机制。尽管癌症是由许多种不同疾病组成的，但却具有一个共同的特点即为异常细胞超出了它们的自然界限和抗细胞死亡。许多蛋白质编码基因和miRNA已被证实参与促进细胞存活或抑制细胞死亡。随着lncRNA在调节肿瘤细胞的生存和死亡中分子功能认识的增加，这类非编码RNA已成为在癌症发展和侵袭的研究过程中令人兴奋的新成员。癌细胞的一个突出特点就是其不断增殖的能力。癌细胞之所以能够具有不断增殖的能力就是通过获得不断增殖的信号及逃避生长的抑制细胞[22]。Lietal证实了一些lncRNA参与了对肿瘤细胞增殖的调节。这些lncRNA可以促进或抑制细胞增殖，其异常表达有助于肿瘤的发生和发展。某些lncRNA在调节细胞凋亡中也同样起着重要的作用，而这种被异常调节的细胞凋亡通常在出现在肿瘤细胞内。肿瘤干细胞为肿瘤内具有干细胞特性一种细胞亚型，例如具有细胞更新和多潜能性。由于干细胞具有能够分化成多种类型的细胞产生肿瘤异质性的能力，它们被认为是肿瘤发生、发展、进展及复发的驱动力[22]。最近Mageeetal的研究证实lncRNA在胚胎干细胞、成体干细胞及肿瘤干细胞中为重要的调节因子[23]。因此lncRNAs可能在获得及维持肿瘤干细胞的干性过程中发挥关键的作用。Michaliketal发现lncRNAs在肿瘤血管的生成过程中同样起着重要的作用，并且是肿瘤从良性过度到恶性过程中的关键一环。2.H19发现及其功能H19基因是一个父系等位基因，父系印迹长度为2.7kb，在哺乳动物中进化高度保守，H19是人类基因组中最早发现的印迹基因之一，位于11号染色体长臂第11号染色体和第7号染色体端粒染色体区域，其相邻基因IGF2相互印记和相互调节。基因座中含有丰富的基因组位点。H19/Igf2印迹基因属于一个基因印迹群，由于母体印迹基因在进化过程中高度保守，Igf2基因是一个父系印迹基因，相距90kb。H19基因在同一组织和胚胎发育阶段表现出相似的表达模式，H19基因受H19基因上游4kb的差异甲基化甲基化区(DMRs)或印迹控制区(ICRR)调控。H19基因在胚胎26 中国医科大学硕士学位论文发育过程中高丰度表达，主要分布于内胚层和中胚层组织[25]，而H19仅在出生后心肌和骨骼肌中表达下降。结果表明，H19基因在肌肉分化中起重要作用。共扩增出5个外显子和4个内含子H19基因产物，全长2.3kb。由于缺乏开放阅读框架，h19基因被称为非编码rna。虽然h19RNA分子可以在细胞质和细胞核中检测到，但h19RNA主要存在于细胞质中，具有调节RNA或核糖体调节的功能。研究表明，h19基因的外显子也编码一个小的rna-microRNA分子miR-675[27，28]，而miR-675也是h19的一个重要转录调节因子，可以参与h19的调控。另外，在H19/Igf2位点可以转录一种名为91H的H19反义RNA分子，但其确切功能尚不清楚。H19是胚胎发育和肿瘤发生过程中重要的癌胚基因，与多种疾病的发生密切相关。与主要功能是抑制mRNA翻译的miRNA不同，H19可以作为分子支架，miRNA海绵、蛋白质诱饵及小ncRNA的储存库。（1）表观遗传学是指可遗传基因表达的变化，不涉及DNA一级结构的改变。这些变化涉及DNA甲基化，组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA基因沉默。[29]到目前为止，对于H19来说，已经被证实的对于表观遗传的调节主要是通过调节靶基因来介导的。但是其对于表观遗传的调控也可以通过作为分子支架来进行；在这个调解过程中，H19通过折叠成热力学稳定的高阶结构来组装不同的蛋白质分子复合物，这也为蛋白质及其识别靶点提供了多种结合方式[30]。（2）大多数转录因子能够促进启动子区域转路机的组装和靶基因的转录[31]。H19能够与这些转录因子相结合，进而调节它们的转录活性。越来越多的证据表明，一些其他的lncRNA也能够作为这些转录调节因子的配体以及调节这种以配对为基础的相互作用，并指导这种含有lncRNA的复合物结合到特定的RNA或DNA靶点上。作为转录因子，lncRNA能够在cis(临近基因)或trans(远离基因)区正向或负向的调节转录调控。（3）H19通过各种机制在转录后调控中扮演重要的作用，包括mRNA的编辑、选择性剪切，以及作为小ncRNA的“水库”和miRNA海绵[32,33]。RNA编辑是转录后调控的一种重要形式，它可以通过核苷酸修饰、插入或缺失改变RNA分子。最常见的编辑活动是通过ADAR反应在双链RNA中使腺苷转化为肌苷（A-I）。在某些情况下，lncRNA含有某些编码蛋白基因的反义核苷酸序列，并且能够与这些基因的mRNA前体相结合。RNA剪接在mRNA翻译之前发生，是一个重要的、精确的转录后调控。选择性剪切能够产生多个蛋白异构体，有助于基因的表达，并能够对其功能和各种生物学功能进行微调。H19已被报道参与调控mRNA的选择性剪接[34]。此外，一些lncRNA也可以作为小，单或双链RNA处理后产生的小ncRNA的储存库。某些lncRNA与一些mRNA拥有共同的miRNA27 中国医科大学硕士学位论文的结合位点，并能通过miRNA的“海绵”作用来调节miRNA的表达[35]。在这种情况下，lncRNA能够与miRNA的靶基因竞争性的结合该miRNA，并能够解除该miRNA对于靶mRNA的抑制作用。在lncRNA-miRNA-gene这个调控关系网中，这三者之间特殊的拓扑结构证实了在这个网络中它们的能力和相互作用[36]。这种竞争内源性RNA模式已经在人类和其他物种中被广泛的发现。并且越来越多的证据表明，在癌症相关的生物分子调控过程中lncRNA可以作为miRNA的”海绵“来调控ceRNA的网络结构3．H19与肿瘤3、1H19在肿瘤中的功能及分子机制肿瘤的发生是一个多步骤的过程，主要涉及肿瘤组织及其周围环境。肿瘤组织通常能够通过为肿瘤细胞提供血液，调节代谢来应对缺氧或应激等情况，并能够进行上皮细胞向间质细胞转化的可塑性，向远处转移，及转移位点的克隆增殖。癌细胞在许多方面类似于胚胎细胞：它们都在可塑性、增殖、转移及侵袭等方面都拥有特别的能力；并在调节细胞代谢或其他属性等方面也相同—都是精确的通过相同的分子途径和表观遗传模式。近年来，越来越多的实验从早期异常的转录调节、基因组的稳定性下降，到晚期的增殖失衡和转移的应激管理等多方面证实了H19在肿瘤发生、发展这个复杂的生物学过程中所扮演的重要角色。（1）H19与基因组的不稳定性。细胞维持其正常的倍性状态取决于p53基因正常表达，通常通过Parp-1依赖性途径。当Parp-1受损时，p53蛋白的水平降低，导致多倍体的形成，使能够阻止肿瘤发展的通路减弱；或使H19的表达上调，引发快速癌症通道。PTEN>PI3K/Akt通路可能是这两种通路共同的基础。由于多倍性是使染色体丢失/非整倍体的一种常见方式，并且通常伴有有害的肿瘤基因突变，这最终可引发H19的重新表达，诱发其致癌的特性。（2）H19与细胞增殖和缺氧应激反应。在p53突变型细胞诱导的缺氧应激反应中，缺氧反应能够诱导H19的表达；其中HIF1α是H19表达量上调过程中必不可少的，并且其自身和H19的表达变化均不受p53的调节。由于缺氧本身即为一种突变的条件，它可以即可以诱导p53的突变，又可以诱发H19的一系列反应。H19能够通过调节miRNA-675抑制Rb蛋白或抑制p57kip2或活化c-Myc来促进细胞周期的进展。（3）H19与肿瘤细胞的转移。H19在原发肿瘤的上皮-间质转化的过程中和继发肿瘤的克隆形成及再分化的过程中均起到了重要的作用。在不同的情况下，各种对立相反的途径都是由H19所调控的。H19被认为作为一个微环境的调节因子参与了细胞转移的过程，并能够在不同的环境中找到与其相互作用的生物因28 中国医科大学硕士学位论文子。例如在EMT中结合miRNA-200和Let-7d;在MET中选择性的结合组蛋白乙酰基转移酶。因此H19毫无疑问与癌症的各个阶段都紧密相连，并且应该放在癌症的研究和抗癌治疗的重要位置。3、2H19在膀胱癌中的功能及调节通路最早根据1998年牛津大学出版的Carcinogenesis中对H19的描述，作为人类基因组中的一个癌胚基因，其在人的胚胎膀胱中有所表达，出生后表达量下降，但在膀胱癌中又重新表达。近年来越来越多的证据表明，长链非编码RNA--H19具有致癌的特性，并在膀胱癌的发生及转移过程中起到了关键性的调节作用；也有越来越多的文献从H19的以下几个方面论证其与膀胱癌之间的关系。（1）H19基因中单核苷酸多态性的变化与膀胱癌。H19的基因区或5’区单核苷酸多态性的变化可能会影响到H19的表达量的变化或是其结构和功能的变化。因此H19的变构体在膀胱癌的易感性中扮演着重要的作用。GeraldW.Verhaegh发现在非编码蛋白的H19基因中，单一的SNP多态性能够使非肌层侵润性膀胱癌的发展风险降低；然而这种相互关系只在杂合子中存在，在纯合子中不存在[41]。（2）H19与膀胱癌转移。相比于那些非转移的膀胱癌患者，H19在侵润型膀胱癌患者组织中的表达量明显增高；并在体外培养的细胞中，人为促进H19的过表达能够促进膀胱癌细胞的转移和侵袭。MingLuo等研究并发现H19能通过调节EZH2抑制E-cad的表达，进而增强膀胱癌的转移[42]。（3）H19与膀胱癌增殖。YAP1与H19的表达水平在膀胱癌患者的组织与细胞中显著升高；而H19和YAP1表达量的增高在临床病理学意义上与较差的临床预后相关。ShiLi等在体外的细胞实验中证实YAP1能够通过调节H19表达量来促进膀胱癌细胞的增殖和迁移[43]。（4）H19与细胞周期。H19的异常表达还能够显著的增加miRNA-675表达量的上升，从而抑制了miRNA-675低表达诱导的细胞周期中G1期的细胞阻滞和促进细胞凋亡的作用。同时miRNA-675还能够抑制p53的激活，进而抑制Bax/Bcl-2和cyclinD1的表达，促进膀胱癌的增殖[44]。（5）H19与膀胱癌的复发。IAriel等检测了临床不同膀胱癌患者组织中H19表达含量，总结并归纳出H19可能是诊断膀胱癌复发的早期肿瘤标志物。3、3H19在胃癌中的功能及调节通路H19作为一个母系等位基因特异性表达的lncRNA，能够影响胃癌细胞的增殖变化[45]。其致癌功能与癌基因c-myc及抑癌基因p53相关[46,47]。C-myc是Myc基因家29 中国医科大学硕士学位论文族的成员之一，并能通过调节组蛋白乙酰转移酶(HAT)和RNA聚合酶Ⅱ的活性来调节靶基因的表达，展现其致癌的特性[48]。Yang等人研究发现H19在胃癌细胞及胃癌组织中H19表达量明显升高。Zhang等人为了研究H19与c-myc之间的关系，构建了一个能够持续表达c-myc的质粒。结果显示，c-myc能够诱导H19基因的表达；并且能够通过这个机制进一步促进癌细胞的增殖。同时C-myc诱导H19表达的实验证明了其促癌的特性。同时H19作为促癌基因的特性也能通过抑制抑癌基因p53的活性来显示出来。Yang等人通过细胞流式实验和RNA免疫共沉淀技术证实，过表达H19能够使p53部分失活；并能够使皮p53的靶点、关键的凋亡调节因子----Bax蛋白水平降低。H19能够通过调节p53进而促进胃癌细胞抑制凋亡。4．结语与展望这些研究表明，H19的调节因子及其功能通路可以维持细胞的正常生理状态，当其中一种或部分调节H19的因子发生变化时，H19的异常表达与肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药有关，可作为肿瘤诊断、治疗和预后的分子标志物。生物信息学、分子生物学和临床研究的巨大进展，为今后的研究提供了新的视角和新的思路。我们相信，随着对H19的表达和调控机制的深入研究，H19在揭示肿瘤的发生、发展和新药的研究方面发挥着重要和更广泛的作用。参考文献参考文献[1]GuttmanM,AmitI,GarberM,etal.Chromatinsignaturerevealsoverathousandhighlyconservedlargenon-codingRNAsinmammals.Nature,2009,458(7235):223-7.[2]HanahanD,WeinbergRA.Hallmarksofcancer:thenextgeneration.Cell,2011,144(5):646-74.[3]HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell,2000,100(1):57-70.[4]BrannanCI,DeesEC,IngramRS,etal.TheproductoftheH19genemayfunctionasanRNA.MolCellBiol,1990,10(1):28-36.[5]Alvarez-DominguezJR,HuW,GromatzkyAA,etal.LongnoncodingRNAsduringnormalandmalignanthematopoiesis.IntJHematol,2014,99(5):531-41.[6]FlynnRA,ChangHY.LongnoncodingRNAsincell-fateprogrammingandreprogramming.CellStemCell,2014,14(6):752-61.[7]RossiMN,0000-0003-4485-7738AO,AntonangeliF,etal.LncRNAs:NewPlayersinApoptosisControl.IntJCellBiol,2014,2014:473857.30 中国医科大学硕士学位论文[8]BartonicekN,MaagJL,DingerME.LongnoncodingRNAsincancer:mechanismsofactionandtechnologicaladvancements.MolCancer,2016,15(1):43.[9]OffitK.Decadeinreview--genomics:adecadeofdiscoveryincancergenomics.NatRevClinOncol,2014,11(11):632-4.[10]ForbesSA,BeareD,GunasekaranP,etal.COSMIC:exploringtheworld'sknowledgeofsomaticmutationsinhumancancer.NucleicAcidsRes,2015,43(Databaseissue):D805-11.[11]AlexandrovLB,Nik-ZainalS,WedgeDC,etal.Signaturesofmutationalprocessesinhumancancer.Nature,2013,500(7463):415-21.[12]CampbellPJ,PleasanceED,StephensPJ,etal.Subclonalphylogeneticstructuresincancerrevealedbyultra-deepsequencing.ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(35):13081-6.[13]LawrenceMS,StojanovP,PolakP,etal.Mutationalheterogeneityincancerandthesearchfornewcancer-associatedgenes.Nature,2013,499(7457):214-8.[14]NavinN,KendallJ,TrogeJ,etal.Tumourevolutioninferredbysingle-cellsequencing.Nature,2011,472(7341):90-4.[15]AnintegratedencyclopediaofDNAelementsinthehumangenome.Nature,2012,489(7414):57-74.[16]CarninciP,KasukawaT,KatayamaS,etal.Thetranscriptionallandscapeofthemammaliangenome.Science,2005,309(5740):1559-63.[17]BertoneP,StolcV,RoyceTE,etal.Globalidentificationofhumantranscribedsequenceswithgenometilingarrays.Science,2004,306(5705):2242-6.[18]DingerME,AmaralPP,MercerTR,etal.Pervasivetranscriptionoftheeukaryoticgenome:functionalindicesandconceptualimplications.BriefFunctGenomicProteomic,2009,8(6):407-23.[19]ClarkMB,AmaralPP,SchlesingerFJ,etal.Therealityofpervasivetranscription.PLoSBiol,2011,9(7):e1000625;discussione1001102.[20]HangauerMJ,VaughnIW,McManusMT.PervasivetranscriptionofthehumangenomeproducesthousandsofpreviouslyunidentifiedlongintergenicnoncodingRNAs.PLoSGenet,2013,9(6):e1003569.[21]EngstromPG,SuzukiH,NinomiyaN,etal.ComplexLociinhumanandmousegenomes.PLoSGenet,2006,2(4):e47.[22]LiuB,SunL,LiuQ,etal.AcytoplasmicNF-kappaBinteractinglongnoncodingRNAblocksIkappaBphosphorylationandsuppressesbreastcancermetastasis.CancerCell,2015,27(3):370-81.[23]MageeJA,PiskounovaE,MorrisonSJ.Cancerstemcells:impact,heterogeneity,anduncertainty.CancerCell,2012,21(3):283-96.[24]Sanchez-MorenoP,Ortega-VinuesaJL,Martin-RodriguezA,etal.Characterizationofdifferentfunctionalizedlipidicnanocapsulesaspotentialdrugcarriers.IntJMolSci,2012,13(2):2405-24.[25]DeChiaraTM,RobertsonEJ,EfstratiadisA.Parentalimprintingofthemouseinsulin-likegrowthfactorIIgene.Cell,1991,64(4):849-59.[26]GaboryA,JammesH,DandoloL.TheH19locus:roleofanimprintednon-codingRNAingrowthanddevelopment.Bioessays,2010,32(6):473-80.[27]DeyBK,MuellerAC,DuttaA.Longnon-codingRNAsasemergingregulatorsofdifferentiation,development,anddisease.Transcription,2014,5(4):e944014.31 中国医科大学硕士学位论文[28]SmitsG,MungallAJ,Griffiths-JonesS,etal.ConservationoftheH19noncodingRNAandH19-IGF2imprintingmechanismintherians.NatGenet,2008,40(8):971-6.[29]TsaiMC,ManorO,WanY,etal.LongnoncodingRNAasmodularscaffoldofhistonemodificationcomplexes.Science,2010,329(5992):689-93.[30]GreerEL,ShiY.Histonemethylation:adynamicmarkinhealth,diseaseandinheritance.NatRevGenet,2012,13(5):343-57.[31]GuoX,GaoL,WangY,etal.AdvancesinlongnoncodingRNAs:identification,structurepredictionandfunctionannotation.BriefFunctGenomics,2016,15(1):38-46.[32]TripathiV,EllisJD,ShenZ,etal.Thenuclear-retainednoncodingRNAMALAT1regulatesalternativesplicingbymodulatingSRsplicingfactorphosphorylation.MolCell,2010,39(6):925-38.[33]YinQF,YangL,ZhangY,etal.LongnoncodingRNAswithsnoRNAends.MolCell,2012,48(2):219-30.[34]CesanaM,CacchiarelliD,LegniniI,etal.AlongnoncodingRNAcontrolsmuscledifferentiationbyfunctioningasacompetingendogenousRNA.Cell,2011,147(2):358-69.[35]FaghihiMA,ZhangM,HuangJ,etal.Evidencefornaturalantisensetranscript-mediatedinhibitionofmicroRNAfunction.GenomeBiol,2010,11(5):R56.[36]KeniryA,OxleyD,MonnierP,etal.TheH19lincRNAisadevelopmentalreservoirofmiR-675thatsuppressesgrowthandIgf1r.NatCellBiol,2012,14(7):659-65.[37]GuoLL,SongCH,WangP,etal.CompetingendogenousRNAnetworksandgastriccancer.WorldJGastroenterol,2015,21(41):11680-7.[38]ErgunS,OztuzcuS.Oncocers:ceRNA-mediatedcross-talkbyspongingmiRNAsinoncogenicpathways.TumourBiol,2015,36(5):3129-36.[39]ChengDL,XiangYY,JiLJ,etal.CompetingendogenousRNAinterplayincancer:mechanism,methodology,andperspectives.TumourBiol,2015,36(2):479-88.[40]LiCY,LiangGY,YaoWZ,etal.Integratedanalysisoflongnon-codingRNAcompetinginteractionsrevealsthepotentialroleinprogressionofhumangastriccancer.IntJOncol,2016,48(5):1965-76.[41]VerhaeghGW,VerkleijL,VermeulenSH,etal.PolymorphismsintheH19geneandtheriskofbladdercancer.EurUrol,2008,54(5):1118-26.[42]LuoM,LiZ,WangW,etal.Longnon-codingRNAH19increasesbladdercancermetastasisbyassociatingwithEZH2andinhibitingE-cadherinexpression.CancerLett,2013,333(2):213-21.[43]LiS,YuZ,ChenSS,etal.TheYAP1oncogenecontributestobladdercancercellproliferationandmigrationbyregulatingtheH19longnoncodingRNA.UrolOncol,2015,33(10):427.e1-10.[44]LiuC,ChenZ,FangJ,etal.H19-derivedmiR-675contributestobladdercancercellproliferationbyregulatingp53activation.TumourBiol,2016,37(1):263-70.[45]SongH,SunW,YeG,etal.Longnon-codingRNAexpressionprofileinhumangastriccanceranditsclinicalsignificances.JTranslMed,2013,11:225.[46]YangF,BiJ,XueX,etal.Up-regulatedlongnon-codingRNAH19contributestoproliferationofgastriccancercells.FEBSJ,2012,279(17):3159-65.[47]ZhangEB,HanL,YinDD,etal.c-Myc-induced,long,noncodingH19affectscellproliferationandpredictsapoorprognosisinpatientswithgastriccancer.MedOncol,2014,31(5):914.32 中国医科大学硕士学位论文[48]AmenteS,LaniaL,MajelloB.EpigeneticreprogrammingofMyctargetgenes.AmJCancerRes,2011,1(3):413-418.33 中国医科大学硕士学位论文致谢本课题的完成，离不开大家的关心、帮助和支持。在本论文完成之际，谨向给于我关心和帮助的各位老师和同学们表示衷心的感谢！首先感谢我的导师都书琪教授，在整个课题的设计、实验方面都倾注了大量的心血！感谢导师一直以来对我的谆谆教诲！恩师渊博的知识、严谨的治学态度、勇于探索的精神、精益求精的学术作风使我受益匪浅！在此，谨向恩师表示崇高的敬意和衷心的感谢!感谢与我共同奋斗过的兄弟姐妹们，感谢你们给予的热情帮助和实验中各种问题的有益探讨以及对我的支持和鼓励！最后要特别感谢我的亲人，我的朋友。感谢我的父母多年来默默地奉献，给我支持、理解和鼓励！他们的关心使我有信心和毅力完成学业！再次感谢所有关心和帮助我的老师、同学、朋友和亲人，祝你们健康快乐！34 中国医科大学硕士学位论文个人简历姓名：宁伯彬性别：男出生日期：1990年7月籍贯：辽宁省沈阳市民族：汉族学习经历：2009年9月—2014年6月中国医科大学临床专业本科2015年9月—2017年6月中国医科大学泌尿外科硕士研究生35