MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究.doc

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1、MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究作者：魏洁龚小卫明小燕王旭王达安邓鹏姜勇【摘要】目的：为了研究MAPK激活蛋白激酶2(MAPK-activatedproteinkinase2,MK2)细胞内定位与其功能的关系，构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法：将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(WT)通过定点突变技术构建其无活性突变体MK2(320A)和活性突变体MK2(320E)，转染NIH3T3细胞，并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况。结果：各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后，在NIH3T3细胞中得到高量表达。

2、融合蛋白发出的绿色荧光表明，在静息状态下，MK2(WT)主要分布于细胞核内，MK2(320E)主要分布于细胞质内，而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到紫外线（UV）刺激后，MK2(WT)和MK2(320A)移位出核，而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变。结论：成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达，观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响。【关键词】蛋白激酶类；突变；基因表达；细胞内定位；p38丝裂原活化蛋白激酶；MAPK激活蛋白激酶2［Abstract］Objective:Tostudytheintracellularlocal

3、izationofMAPK-activatedproteinkinase2(MAPKAPK2/MK2)anditsrelationwiththefunction.Methods:EukaryoticcellexpressionvectorsofgreenfluorescentproteinfusedwithMAPK-activatedproteinkinase2(MK2)mutantswereconstructed.Wild-typeMK2clonedinthegreenfluorescentproteinvector,pEGFP-C2,wassite-mutatedtoproducedomi

4、nantnegativemutantMK2(320A)andconstitutivelyactivemutantMK2(320E).ThenthemutantsweretransfectedintoNIH3T3cells,andtheintracellularlocalizationsofthesemutantswereobservedwithfluorescencemicroscope.Results:Afteridentificationbysequencing,theGFP-fusedMK2mutantswerehighlyexpressedinNIH3T3cells.Thegreenf

5、luorescenceoffusionproteinsshowedthatinrestingcells,MK2(WT)weremainlyinthenuclei,andMK2(320E)wasmainlyinthecytosol,whileMK2(320A)dispersedalloverthecell.OncethecellswerestimulatedbyUV,MK2(WT)translocatedintothecytosol,whiletheintracellularlocalizationsofMK2(320E)showednostress-dependentredistributio

6、n.Conclusions:ExpressionvectorswithdifferentmutantsofMK2fusedwithGFParesuccessfullyconstructedandhighlyexpressedineukaryoticcells.SomefunctionalpointmutationshaveeffectsontheintracellularlocalizationsofMK2.5［Keywords］proteinkinases;mutation;geneexpression;intracellularlocalization;p38mitogenactivate

7、dproteinkinase;MAPK-activatedproteinkinase2p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）通路参与细胞生长、发育、分裂及细胞间功能同步等多种细胞生理过程的调控。在紫外线（ultraviolet,UV）照射、高渗、细菌脂多糖（lipopolysacharides,LPS）及炎性因子等作用下，p38MAPK被