流式细胞术及其应用

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1、常用流式细胞技术一、流式细胞术的概念流式细胞术（FCM）就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。FCM(FlowCytomytry流式细胞术)FCM(FlowCytomyter流式细胞仪)二、流式细胞仪的工作原理待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样品

2、使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。美国B-D公司型号：FACSCalibur,单激光配制操作系统：MacOS8.51999年3月购置三、流式细胞仪可检测到的细胞参数1前向角散射（FSC）：前向角散射光

3、的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。2侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。3荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞

4、区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测出13个FL。四、流式细胞术的应用1细胞DNA含量检测：细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。肿瘤诊断：DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力的大小也可反映

5、肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。肿瘤预后估计：异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志。同样的，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNA倍体能更客观地预测预后。凋亡：由于凋亡细胞核酸内切酶活化，

6、DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。细胞表型的分析得益于单克隆抗体的产生及发展，现在CD系统已有247种之多。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一般用直标法，也可用间标法。荧光探针多为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。2细胞表型分析：淋巴细胞分类：CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、C

7、D16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。造血干/祖细胞计数造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法难以识别。由于造血干/祖细胞表面可表达CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45单克隆抗体和核酸染料进行三色荧光标记，FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对临床血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾病的造血干/祖细胞移植治疗有十分重要的意义。白血病的免疫分型流式细胞术白血病免疫分型是利用

8、荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系