流式细胞术检测血小板功能及其临床应用

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1、流式细胞术检测血小板功能及其临床应用屮华医学检验朵志1999年第3期第22卷讲座作者：李琨琨单位：510630广州，暨南大学华侨医院检验科血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法木身的原凶造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵散、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。rh于血小板的活化程度可rh血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利川流式细胞术，特别是全血法流式

2、细胞术，检测血小板膜糖蛋H的表达［2］。该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价英功能。现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应川现状和潜力进行综述。一、全血法流式细胞术1•方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后山压缩氮经硅管送达标本室，再以5000〜10000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一•定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常川的样木是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。由于血小板极易

3、活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。该技术能使用全血样木测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。全血流式细胞术样本制备步骤为：抽血抗凝一稀释一牛物素化的检测用单克隆抗体（单抗）一激动剂或缓冲液一固定（1%多聚甲醛）一FITC标记的鉴别用单抗一PE-卵白素一稀释。稀释样本是为了防止血小板聚集，否则单个血小板上的抗原量就测不出来了，因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光，而不管这单个粒子是一•个血小板还是几个血小板的聚集体。当川凝血酶作外源激动剂时，为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块，可

4、在全血标木屮加入四肽化A物Gly-Pro-Arg-Pro（GPRP）L3］o固定这一步若不干扰单抗的结合，生物素化的检测用氓抗也可以在固定后加入。血小板鉴别用氓抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPIb,GPUb,GPllIa的单抗中任选一种。标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY53种荧光染料中任选。样木随片用流式细胞仪检测。通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后，检测5000〜10000个血小板表而的特异性荧光讯号。检测结果可用两种方法表示。-•种是平均颗粒荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法■荧光信号的放大倍数无关，口可以检测受损伤部位血

5、小板亚群的变化。如果检测的是血小板表而某抗原的总量，则荧光强度法更为适合。譬如，在活化状态下，血小板表而GPIb-IX-V复合物含量比静息吋低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果［4］,这吋用荧光强度法就比阳性血小板白分率法更合适。「【前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的绝对数「I，但Shatti等［2］利IJ1251和牛物素双标记的单抗进行研究，以PE-卵白素作为荧光结合试剂，发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此，对于一个特定的单抗，一日•弄清这一线性关系，并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比，就能利川流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的绝对数口。口前右一些商品试

6、剂盒能定量测定结合到单个细胞上的抗体数目，但乏见川于血小板的报道。2.优缺点：与常规血小板功能测定法比，全血法流式细胞术有许多优点。怜先，标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活，并防止血小板亚群丢失；循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响，因此本法能在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。同时，山于使用了血小板鉴别用单抗，检测的仅是血小板，而不会受其它种类细胞或碎片的T扰，保证了检测的特异性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活；活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性［5］。木法能灵墩地检测出少到1%的活化血小板亚

7、群［6］,尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化，使检测结果更接近真实。若同时使用FITC、PE、PE-CY53种荧光染料，本法通过三色标志一次能同时检测两个抗原标志物的变化。此外，做一次检测仅需2卩1血液，这一点，尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。本法不使川同位素，没有放射性污染。全血法流式细胞术也存在不足之处。譬如，流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂。为了避免体外活化，血样需在4