Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究

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1、学校代码10459学号或申请号201522474144密级公开专业硕士学位论文Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究课题来源：国家自然科学基金（编号：81470033）作者姓名：李晓聪导师姓名：陈栋教授专业名称：口腔医学培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2018年5月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSpatio-temporalexpressionandroleofVps4binknockoutmo

2、usetoothgermByXiaocongLiSupervisor：Prof.DongChenStomatologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay,2018原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作

3、者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月

4、日Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究摘要背景与目的细胞液泡蛋白质分选因子4B（Vacuolarproteinsorting4B，VPS4B）是AAAATP酶家族成员之一，在细胞内蛋白质运输、溶酶体降解、病毒体出芽以及调节有丝分裂等过程中发挥着重要的作用。本课题组此前对一个牙本质发育不良I型（DentindysplasiatypeI，DD-I）家系进行外周血基因测序发现其致病基因为VPS4B，其次通过体外细胞实验初步阐述VPS4B基因通过Wnt通路调控牙齿的发育过程。为阐明该基因在牙

5、齿发育过程中的详细作用机制，构建Vps4b基因敲除小鼠展开进一步的研究。本实验运用已成功构建的Vps4b基因敲除小鼠模型，明确Vps4b基因在牙胚发育过程中的分布情况，并探讨该基因突变对牙齿发育相关基因的影响，进一步揭示该基因在牙齿致畸中的作用机制。材料与方法以CRISPR-Cas9技术构建的Vps4b基因敲除小鼠模型为研究对象，采用定点交配的方式合笼，记录怀孕时间。分别于怀孕13.5、14.5、16.5天断颈处死孕鼠取胎鼠头部及尾巴；于出生后2.5天和7天处死新生小鼠取下颌骨和尾巴。采用PCR技术鉴

6、定胎鼠及新生幼鼠的基因型。将胎鼠头部及幼鼠下颌骨石蜡包埋后获取下颌第一磨牙牙胚组织切片，通过HE染色确定各组牙胚的发育时期，免疫组织化学方法分别检测不同发育时期的正常小鼠下颌第一磨牙牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达分布情况，并对比Vps4b基因敲除后小鼠牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达变化。结果PCR结果显示子代小鼠基因型为Vps4b+/+和Vps4b+/-两种。HE染色表明胚胎13.5、14.5、16.5天的小鼠下颌第一磨牙牙胚分别发育至蕾状期、帽状期和钟状期，出生后2.5天

7、、7天牙胚处于分泌期和矿化期。正常小鼠免疫组织化学染色显示：蕾状期和帽状期时，Vps4b在牙胚中广泛表达，Dspp和Col-I均无表达；钟状期Vps4b表达于内、外釉上皮、牙乳头和牙囊，Dspp在内釉上皮和牙乳头中表达，Col-I表达于牙乳头和牙囊；分泌期和矿化期Vps4b、Dspp和Col-I在I成釉细胞、成牙本质细胞和牙囊中均有表达，牙乳头亦可见Vps4b和Col-I的阳性表达。小鼠基因突变后Vps4b在蕾状期成釉器中变为阴性表达，在一些组织中表达强度变弱（P<0.05）；Dspp在钟状期的牙乳头

8、和分泌期的牙囊中均未见表达，在分泌期的成釉细胞、成牙本质细胞和矿化期牙囊中阳性细胞数减少（P<0.05）；Col-I在钟状期、分泌期和矿化期的表达部位均无变化，仅在部分组织表达强度下降（P<0.05）。结论在Vps4b+/+小鼠发育过程中Vps4b表达于不同阶段的牙胚中且随着发育的进行表达强度发生改变，说明Vps4b可能参与了牙胚的正常发育。在Vps4b+/-小鼠发育过程中Vps4b表达强度减弱，且牙齿发育相关蛋白的表达下降，推测其可能通过调节自身及牙齿