第二章 磺胺二甲嘧啶抗体的制备

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1、第二章磺胺二甲嘧啶抗体的制备引言免疫分析是以抗原抗体间的特异性反应为基础，其作为一种特殊的分析技术，近几年在兽药和农药等小分子化合物的残留分析中的应用越来越广泛，抗体是该技术中的核心试剂。临床上使用的抗体主要有多克隆抗体(polyclonalantibody,PcAb)和单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)两类。McAb是由一个祖代B淋巴细胞通过无性繁殖所产生的基因组相同，表现性状一致的细胞群所产生的免疫球蛋白。McAb针对某一特定的抗原决定簇或表位，并且由于均来源于同一

2、祖代B淋巴细胞，其结构相同、特异性强，生物活性高，在免疫特性和理化性质等方面高度一致；具有均一性，专一性和无限量供应等特点，非常利于标准化。PcAb是直接免疫动物获得抗血清，由于抗原物质具有多种抗原决定簇所以用该法获得的抗血清是多种特异性不同的抗体混合物称为多克隆抗体。多克隆抗体也称为第一代抗体，虽然简单易得但产量有限，效价不稳定。本研究用合成的完全抗原SM2-BSA免疫小鼠，此时小鼠脾细胞具有分泌抗体的能力；同时扩大培养SP2/0骨髓瘤细胞，SP2/0细胞具有连续繁殖的能力;将免疫后鼠脾脏细胞

3、和SP2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，利用选择性培养基选择培养杂合体细胞，通过ELISA进行阳性测定，克隆化筛选，选择出合适的阳性杂交瘤细胞株;细胞株扩大培养后，通过动物体内诱生的方法，制备了大量的含有单克隆抗体(McAb)的腹水;腹水经纯化，可得到高纯度的抗体，采用ELISA等方法对单抗亲和性及对抗原的特异性等性质进行考察。同时对新西兰大白兔进行免疫，制备出抗磺胺二甲嘧啶的多克隆抗体，在对抗题进行鉴定后，选取好的抗体继续建立酶联免疫分析方法和对新型检测方法进行探索。磺胺二甲嘧啶单克隆抗体

4、的制备材料与方法实验材料主要仪器医用净化工作台(北京设备厂)；CO2恒温培养箱〔OPTIMA〕；光学倒置显微镜(OLYMPUS)；台式低速离心机(HERMLT)；酶联免疫检测仪(SPECTRAIII)；微量移液器（2~20μl、20~200μl、200~1000μl,德国，Eppendorf）。主要材料与试剂BSA-SM2（防化学院范崇旭博士提供）；磺胺二甲嘧啶（SM2）；牛血清白蛋白（BSA）；卵清蛋白（OVA）；碳二亚胺（EDC）；福氏完全佐剂（FCA）；福氏不完全佐剂（FICA）；二甲基亚

5、砜（DMSO）；辣根过氧化物酶（HRP）；胎牛血清（FBS）；DMEM培养基；谷氨酰胺；HAT；HT；PEG以上均购自sigma公司；细胞96孔、24孔培养板；96孔酶标板；细胞培养瓶均购自costar公司；Balb/C小鼠、新西兰大白兔，中国医学科学院实验动物研究所。实验方法抗原联接：采用碳二亚胺法联结SM2和BSA,投料比为1分子BSA对100分子SM2。（1#免疫原）免疫程序以范博士提供（2#免疫原）的和自己联接的BSA-SM2作为免疫原，选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠5只，取免疫抗原

6、100μg(以蛋白含量计算)，加生理盐水、弗氏佐剂乳化后。按照常规免疫程序对BALB/C小鼠进行背部皮下多点注射免疫。每次免疫时间间隔为4周，免疫4~5次后采集血清并测定滴度。小鼠在融合前3天开始进行腹腔注射加强免疫。表BALB/C小鼠的免疫方案TableImmunizationprotocol免疫次数Immunitytimes佐剂类型Adjuvant间隔时间Interval(d)抗原量(μg/只)Ammount注射部位Injectionsites基础免疫弗氏完全佐剂1420颈背部皮下多点第1次

7、加强弗氏不完全佐剂2810颈背部皮下多点第n次加强弗氏不完全佐剂2810颈背部皮下多点腹腔加强生理盐水融合前3天10腹腔抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体细胞株的建立骨髓瘤细胞的复苏和培养：从液氮罐中取出冰冻的骨髓瘤细胞，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速复苏，将冻存的细胞悬液融化后以8OOrpm离心5min，弃去上清液，加入约5m1GEN培养基，置于37℃C02培养箱中培养。细胞经换液、传代扩大培养，直至细胞状态良好、细胞数目增多可供细胞融合之用。融合：经过三次加强免疫后，对小鼠进行眼底采血，抗血清具有

8、较高滴度即可进行融合。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按10-2:1的比例在50％PEG（Mr:1,200～1,600）作用下融合。融合后的细胞至于培养基中，铺于含有饲养细胞的96孔培养板内，在37℃，5％CO2的培养箱中培养[2,3]。筛选：待细胞群落长至1／4孔大小时，采用ELISA方法进行筛选。包被板制备：包被浓度0.5μg／ml，包被体积100μl/孔，4℃放置过夜，洗涤一次，以200μl／孔封闭液37℃封闭包被板1h，拍干，4℃放置。分析方法：100μl／孔温浴液(阴性对照)