小鼠foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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1、小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备作者：鲍俊峰,王胜军,马洁,崔大伟，杨先知，毛朝明,仝佳,邵启祥,许化溪【摘要】目的：体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多克隆抗体。方法：从质粒Foxp3pMD18T扩增小鼠Foxp3全长基因，亚克隆至原核表达载体pET32a，转化E.coliBL21；IPTG诱导表达目的蛋白，Ni2+NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果：成功构建了Foxp3pET32a原

2、核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体效价为1∶20000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论：成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。【关键词】Foxp3；原核表达；多克隆抗体；小鼠　　［Abstract］Objective:TopreparerabbitpolyclonalantibodyagainstmouseFoxp3proteinbyprokaryoticexpressionofmouseFoxp3proteininvitro.Methods：Foxp3gene

3、wasamplifiedbyPCRfromthefulllengthplasmidFoxp3pMD18TandsubclonedintothepET32avector;therecombinantplasmid12wastransformedintoE.coliBL21andtheexpressionofrecombinantproteinwasinducedbyIPTG.afterpurifiedwithNi2+NTAcolumn,identificationoftherecombinantproteinby

4、Westernblotwasperformed;thepurifiedproteinwasusedasantigentoimmunizerabbits,thetiterandthespecificityoftherabbitantiFoxp3antibodyweredetectedbyELISAandWesternblot,respectively.Results：TheprokaryoticexpressionvectorforFoxp3pET32awasconstructedsuccessfully;mouse

5、Foxp3proteinhadbeenexpressedandpurified;rabbitpolyclonalantibodyagainstmouseFoxp3proteinwasprepared,thetiteroftheantibodywas1∶20000byELISAandWesternblotanalysisshowedthatthepolyclonalantibodycouldspecificallyrecognizemouseFoxp3protein.Conclusion：MouseFoxp3protein

6、hadbeenexpressedandrabbitantiFoxp3antibodyhadbeenpreparedsuccessfully.　　［Keywords］Foxp3;prokaryoticexpression;polyclonalantibody;mouse　　FOX(forkheadbox)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子家族，通常和细胞生长发育的调控有关［1］。Foxp3蛋白是叉头样转录因子家族中的成员，122001年由Brunkow等［2］首次报道。小鼠Foxp3基因位于其X

7、染色体，全长为3739bp(包含5′端非编码的外显子)，其基因编码的蛋白质也称为Scurfy，由429个氨基酸组成，N末端有锌指蛋白、亮氨酸拉链和一个富含脯氨酸的区域，而叉头样DNA结合域与其他FOX成员不同,靠近蛋白C末端［3］。Foxp3在小鼠特异性表达于CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg细胞)而不表达于CD8+T细胞，研究发现，Foxp3作为Treg细胞发育的一个关键转录因子，它的表达及功能与Treg细胞密切相关［4］，可以更好地在分子水平上了解Treg细胞。　　本实验室已经

8、构建小鼠Foxp3/AAV表达载体［5］，在此基础上我们构建原核表达载体Foxp3pET32a，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。利用纯化的Foxp3蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体，为研究小鼠Foxp3蛋白对Treg细胞的功能影响提供基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1主要试剂ExTaqDNA聚合酶