基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化

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1、基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化【关键词】斑点杂交　　［关键词］斑点杂交；糖基转移酶；基因　　［摘要］目的：进行基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化。方法：采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化，包括预杂交液，杂交液，洗涤和封闭液等及各步反应时间，并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果：建立并优化了膜斑点杂交的条件，本底清晰，结果可靠。结论：建立的斑点杂交技术经济简便，切实可行。　　Establishmenta

2、ndOptimizationofDotBlotTechnique　　Abstract:ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.MethodsWeusedthepositivelychargednylonmembranestooptimizeexperimentsforthedotblotincludingprehybridizationsolution，hybridizationsolution，washingbuffer，blockingsolutionetal，andthetimesofeveryste

3、p．Inordertovalidateitsfeasibility，weanalyzedtheexpression11ofppGalNAcT2indifferenttumorcelllinesbydotblotassayusingtheestablishedhybridizationsystem．Resultsweestablishedandoptimizedthedotblottechniquewhichhadreliableresultsandlowbackground．ConclusionTheestablisheddotblottechniqueispract

4、icableandeconomical．　　Keywords:Dotblot;Glycosyltransferase;Gene基因的表达分析研究是分子生物学实验中较为常用的手段，主要有Northernblot和斑点杂交(dotblot)等，因斑点杂交无需转膜，且DNA或RNA相对固定在一定的区域内，实验要求相对简单，因此斑点杂交更易为实验者所接受。目前一般均用商品化的试剂盒，但其价格昂贵，不是一般实验室所能普及，因此我们采用自配的试剂建立并优化了一套斑点杂交方法，无需特殊设备，经济简便，结果可靠。　　1材料和方法　　1．1多肽　　N乙酰氨基半乳糖转移酶2(UDPGal

5、NAc：polypeptideNacetylgalactosaminyltransferases2,ppGalNAcT2EC2．4.1．41)基因的获得。11　　取ppGalNAcT2克隆载体转染DH5α工程菌，筛选白色阳性克隆，抽取质粒，用M13正向、反向引物进行克隆PCR，M13Forward5’GTAAAACGACGGCCAG3’，M13Reverse5’CAGGAAACAGCTATGAC3’，电泳鉴定结果，可见约1200bp左右的条带。即获得相应的ppGalNAcT2cDNA片段。　　1．2采用T2特异的寡核苷酸探针进行斑点杂交法条件的建立及优化　　探针序列如

6、下5'GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAAGAA，与ppGalNAcT2cDNA序列互补，长31bp。探针合成及探针5’端生物素标记均由上海生工生物工程公司完成。　　1．2．1斑点杂交操作程序　　1.2.1.1以上述所得pp　　GalNAcT2的cDNA片段以1NNaOH和200mM的EDTA对比稀释，使成0．4NNaOH和10mM的EDTA的终浓度。　　1.2.1.2把稀释的pp11　　GalNAcT2的cDNA片段在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。　　1.2.1.3膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10m

7、in，悬空晾干。　　1.2.1.4每点2μl把ppGalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯F照2min，取出让膜干燥。　　1.2.1.5杂交时以2×SSC浸膜5min，装入杂交袋，根据VECTORNIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。以每100cm2膜加20ml的预杂交液(50％的去离子甲酰胺，5XSSC，0．1％SDS，0．1％BSA，0．1％PVP，用pH7．5的PB调终体积)于42℃预杂交2h~3h。　　1.2.1.6弃去预杂交液，在杂交液(50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0．1％SDS，0．1％BSA，0.1％P