experimental research肩袖撕裂病人肩峰下滑囊顶部的组织学变化

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ExperimentalResearch肩袖撕裂病人肩峰下滑囊顶部的组织学变化作者：朱锦宇，吕宏升，朱庆生，桥本卓，信原克哉【摘要】［目的］观察肩袖撕裂病人肩峰下滑囊（subacromialbursa,SAB）顶部的组织学变化。［方法］在肩袖撕裂病人修复手术中，分别取撕裂处和远离撕裂处SAB顶部，采用组织学、免疫组织化学和电镜观察上述两处SAB的形态学变化，通过计算机图像分析系统对SAB切片的细胞数量进行定量评价，并与正常SAB比较。［结果］实验组所有肩袖撕裂病人SAB顶部，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加，细胞数量显著高于正常SAB(P<0.05)，且均未观察到炎性细胞浸润。肩袖撕裂的不同类型、SAB的不同增厚程度以及SAB是否积液，SAB细胞数量无显著性差异。超微结构可见到以B型细胞为主，细胞狭长。免疫组织化学染色也证实肩袖撕裂病人SAB顶部主要系B型滑膜细胞。［结论］肩袖撕裂病人SAB顶部的细胞数量的增加是一种反应性的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。SAB的变化系肩袖撕裂引起的继发反应。【关键词】肩关节；滑囊；肩袖Abstract：［Objective］Toinvestigatethemorphologicalchangesoftheroofofthesubacromialbursaandtheextentof16 involvementofthesubacromialbursaafterrotatorcufftear.［Method］Fortheexperimentalgroup,theroofofthesubacromialbursawasobtainedfrompatientswithrotatorcufftearbothatthetearsiteand2.5to3.0cmdistaltothetearsiteduringsurgeryofrotatorcuffrepair.Forthecontrolgroup,theroofofthesubacromialbursawasobtainedduringsurgeryofrecurrentshoulderdislocationorhumeralshaftfractureattheexposuresite.Thespecimenswereprocessedforhistologicalstaining,immunohistochemicalanalysisandfortransmissionelectronmicroscopy.Thenumberofcellswerequantitatedbycountingcellswithblue-stainednucleusinthesubacromialbursausingacomputerimageanalysissystem.［Result］Thenumberofcellsincreasedsignificantlyintheroofofthesubacromialbursaobtainedfrombothsites,thetearsiteandthedistalsite,inthepatientswithrotatorcufftear,comparedwiththenormalbursa(P<0.05byANOVA).However,therewasnodifferenceinthebursalreactionamongtherotatorcuffteartype,thebursathicknessandthepresenceoffluidinthebursa.ThegreatmajorityofcellsweretypeBcellsobservedundertransmissionelectronmicroscopyandconfirmedbyimmunohistochemicalanalysis.［Conclusion］Theincreaseincellularityintheroofofthesubacromialbursaofpatientswith16 rotatorcufftearisareactionratherthananinflammatoryprocessandtheinvolvementofthesubacromialbursaisnotlimitedinextent.Thereactionoftheroofofthesubacromialbursaissecondarytotherotatorcufftearratherthanprimarycauseoftherotatorcufftear.Keywords：shoulderjoint；bursa；rotatorcuff慢性肩关节疼痛是第三大最常见的肌肉骨骼系统疼痛，发病率为6.65%～25%，是老年人的常见病和多发病［1］。肩袖撕裂是慢性肩关节疼痛的主要病因之一。据统计60岁以上老人10%～20%有肩袖撕裂。尸检证实60岁以上死亡者30%肩袖全层撕裂［2］。肩袖撕裂病人肩关节剧烈疼痛，尤其是夜间疼痛加重，无法休息，还伴有肩关节活动受限，严重影响工作和生活，给许多老年患者带来了极大的痛苦，也给家庭和社会增添了很大的负担。肩袖撕裂是内在因素和外在因素共同作用的结果，即不单纯是某一原因所致。内在因素包括肩袖肌腱的乏血管区和冈上肌腱的特殊位置和功能；外在因素包括肩关节反复应用，肩峰下撞击和不同程度的肩关节外伤。肩峰下滑囊（subacromialbursa,16 SAB）是人体最大的滑囊，介于三角肌深面与喙肩弓及肩肱关节外侧面之间，上为三角肌、肩峰及喙肩韧带，底为冈上肌腱与关节囊融合部［3］。SAB在肩袖撕裂中的作用尚存在争议，本实验在肩袖撕裂病人修复手术中，分别取撕裂处和远离撕裂处SAB的顶部组织，采用组织学、免疫组织化学和电镜观察上述两处SAB形态学和超微结构的变化，并与正常SAB比较，以明确SAB顶部的变化是肩袖撕裂的原因还是结果，以及这种反应是局限性还是广泛性的。1材料和方法1.1临床资料本实验分为实验组和对照组。实验组包括30例肩袖撕裂的病人，其中男20例，女10例，平均61.6岁(37～77岁)。14例有外伤史。工人、管理人员、职员和无职业者分别占11、3、6和10例。病程最长10年，最短1周，平均病程为12.7个月。对照组包括8例复发性肩关节前脱位或肱骨干骨折的病人。1.2手术取材所有的手术均采用半坐位（beachchair沙滩椅体位）在全麻下进行。实验组经肩峰入路显露肩袖，采用肌腱对肌腱缝合或McLaughlin法修复撕裂的肩袖。在肩袖的撕裂口处以及距撕裂口2.5～3cm处（称为远隔部位）分别取1.5cm×1.516 cm左右的SAB顶部组织（3例肩袖球形撕裂的病人因为撕裂范围太大，仅取了撕裂口处的SAB）。对照组在复发性肩关节前脱位或肱骨干骨折术中切口附近取SAB顶部组织。对SAB的增厚程度分为正常、轻、中、重加以纪录，同时记录SAB内有无积液、肩袖撕裂的种类等。1.3标本处理每1例标本分为2部分，大部分立即经10%中性福尔马林固定，石腊包埋，切片厚度为3μm，常规进行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色。余下的小部分标本，用手术刀片切成约1.5mm×1.5mm×1.5mm大小2～3块,立即浸入2.5%戊二醛水溶液内固定,经逐级脱水包埋,超薄切片,在JEM2000EX透射电镜(JEOL公司,日本)下观察SAB的超微结构。1.4免疫组化染色采用SABC方法，石蜡切片(厚3μm)逐级脱蜡入水，PBS缓冲液洗，分别经PBS、双氧水阻断内源性过氧化物酶(37℃湿盒)，胰酶消化10min(37℃湿盒)，正常山羊血清封闭10min(37℃湿盒)，滴加一抗小鼠抗人Vimentin抗体(武汉博士德)后4℃过夜。第2d复温后经生物素化二抗(37℃湿盒30min)、SABC(室温湿盒30min)，DAB16 显色。分别以山羊血清和PBS取代第一抗体作替代对照和空白对照。阳性结果为棕黄色表达。1.5形态计量学采用计算机图像分析系统对SAB顶部中胞核兰染的细胞进行计数定量分析。数码像机(modelPDMC2,Polaroid公司,美国)连接在奥林帕斯显微镜(modelBX40,Olympus公司,日本)。经宝丽莱PDMC1e软件(v1.25,Polaroid公司,美国)在40倍物镜下随机采集图像。每一张切片共采集7～12个区域，每一个区域面积为0.0432mm2。用ScionImageforWindows(Betav4.02,ScionImageforWindows是美国国立卫生研究院编写的NIHImage的Windows版本)图像分析软件对SAB切片胞核兰染的细胞数进行定量评价。1.6统计学分析统计数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两样本均数间比较用t检验，P<0.05为有显著性差异。2结果2.1大体观察16 按照日本信原病院的分类标准［4］，30例肩袖撕裂病人中球形（global）、三角形（triangular）、隐蔽性（concealed）和纵行（longitudinal）撕裂分别占7、7、6和4例，其它还有前方（anterior）和滑囊面（bursaside）撕裂各2例，后方（posterior）和巨大（massive）撕裂各1例。术中肉眼观察所见，SAB正常、轻度、中度、重度增厚分别为11、7、10和2例。19例SAB内无积液，11例SAB基底部破裂而与盂肱关节腔相通而有不同程度的积液。而对照组SAB色泽和厚度正常，也无积液。2.2组织学观察在实验组所有肩袖撕裂病人SAB顶部组织，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加。而正常对照组病人SAB顶部，细胞数量和血管分布均很少。实验组和对照组均未观察到炎性细胞浸润（图1,2）。2.3超微结构16 实验组肩袖撕裂病人SAB顶部组织，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见B型细胞占据绝大多数，细胞形态狭长，仅见到很少量的A型细胞。而正常对照组病人SAB顶部，A、B两型细胞分布较为均匀（图3）。2.4免疫组化染色实验组所有肩袖撕裂病人SAB中绝大多数细胞均可见到Vimentin阳性表达。正常对照组SAB中Vimentin阳性表达很少（图4,5）。2.5形态计量学2.5.1实验组和对照组SAB细胞数量的比较结果表明，实验组肩袖撕裂病人撕裂处和远隔处SAB顶部的细胞数量分别为121.2±32.1、118.9±28.4，两者无统计学差异。正常对照组病人SAB顶部的细胞数量为61.4±4.5，与实验组撕裂处和远隔处SAB顶部的细胞数量比较均有显著性差异（P<0.05）（表1）。图1肩袖撕裂病人撕裂部位SAB顶部，可见细胞数量和血管分布的增加。（HE×200）图2正常对照组病人SAB顶部，可见细胞数量和血管分布均很少。（HE×200）图3肩袖撕裂病人撕裂部位SAB顶部以B型细胞为主，可见许多粗面内质网池（×7.5）图4肩袖撕裂病人撕裂部位SAB顶部，绝大多数细胞均可见到Vimentin阳性表达。（SABC×400）图5正常对照组病人SAB顶部，可见Vimentin阳性表达很少。（SABC×16 400）表1实验组和对照组SAB细胞数量的比较*P<0.05与对照组比较2.5.2不同类型肩袖撕裂病人SAB顶部细胞数量的比较无论是球形撕裂、三角形撕裂、隐蔽性撕裂或纵行撕裂，不同类型肩袖撕裂病人之间SAB顶部细胞数量的比较无统计学显著性差异（表2）。表2不同类型肩袖撕裂病人SAB细胞数量的比较2.5.3不同程度增厚的SAB顶部细胞数量的比较不同程度（正常、轻度和中度）增厚的SAB之间细胞数量无统计学显著性差异。重度增厚仅为2例，故无法作统计学处理，但是从数值上看，与其它不同程度增厚的SAB未见明显差别（表3）。表3不同程度增厚的SAB细胞数量的比较2.5.4SAB是否积液细胞数量的比较统计学分析表明，无论SAB是否积液，SAB顶部的细胞数量无显著性差异（表4）。表4SAB是否积液细胞数量的比较3讨论SAB在生理16 状态下提供了一个滑动的机制［5］。一般认为SAB与肩关节疼痛有关［6］。对于SAB在肩袖损伤中的作用尚存在争论。有学者认为SAB是肩袖撕裂的原发因素之一［7］，SAB的炎症波及到冈上肌及其它肩袖组织，导致了肩袖的撕裂［8］，有实验也证实原发性的肩峰下滑囊炎可引起冈上肌腱的继发改变［9］。但是更多的学者则认为肩袖撕裂引起SAB继发反应，SAB的变化是肩袖撕裂的结果而不是原因，此时SAB是一种反应而不是炎症［10～12］。SAB在肩袖修复过程中有重要的作用，故术中应尽量保留SAB而不能随意切除［13～15］。由于SAB在肩关节疾病具有重要作用，它一直是肩关节外科的研究热点。但是对于肩袖撕裂病人SAB顶部的组织学和超微结构研究，尚未见类似文献报道。Ishii等［12］研究了肩袖撕裂、肩峰下撞击征和钙化性肌腱炎病人的SAB，部分肩袖撕裂的病人同时取了撕裂部和距撕裂口2.5cm处的SAB组织，发现撕裂部位SAB均存在不同程度的反应，包括细胞数量和新生血管数量的增加，血管周围Ⅲ型胶原形成；而距撕裂口>316 cm处的SAB大部分正常或反应轻微。本实验研究了肩袖撕裂病人SAB顶部的变化，发现在实验组所有肩袖撕裂病人的SAB，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加，细胞数量显著高于正常SAB，且均未观察到炎性细胞浸润。组织学表现支持这是一种反应性细胞数量的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。而且肩袖撕裂类型不同，也即意味着累及的肌腱、肩袖撕裂的大小均有差别，SAB增厚程度不同，不管SAB内有无积液，SAB顶部的细胞数量都无显著性差异，均提示反应的广泛性。因此，本实验在肩袖撕裂部位SAB得到的结果与Ishii等的报道相似，但是在远隔部位SAB得到的结果与Ishii等的报道不同。原因之一可能在于取材部位的不同，本实验是从SAB的顶部取材，而Ishii等未说明是从SAB的顶部或基底部取材。SAB顶部很容易与覆盖在上面的肌肉分离，但其底部与下方的腱周结缔组织紧密结合，肩袖撕裂病人SAB的顶部或基底部可能会存在不同的反应。原因之二是实验方法的差异。本实验采用计算机图像分析，较客观的计数了SAB细胞数量，而Ishii等用两个独立的病理学者来观察SAB的反应，尽管2人观察的一致性较高，但不可避免存在主观性。Sarkar等［16］报道SAB可见到A、B2型细胞，A型细胞类似吞噬细胞，表面有长丝状伪足,胞质空泡较多，还有溶酶体和许多线粒体，核周围有许多高尔基器。B型细胞类似成纤维细胞，可见许多粗面内质网池。波形蛋白丝(Vimentinfilament）主要存在于成纤维细胞和来自胚胎。B型滑膜细胞来源于滑膜内层或滑膜下层的干细胞，其胚胎学来源是中胚层的肢芽原始间充质细胞，是在局部组织表面的微环境的作用下分化而成，Vimentin是中胚层组织细胞的特征性蛋白。本实验免疫组化染色和超微结构均证实肩袖撕裂病人SAB的顶部以B型滑膜细胞为主，提示肩袖撕裂病人SAB以修复过程为主。Szomor等［17］采用RTPCR检测了肩袖撕裂病人SAB内多种细胞因子的表达，结果提示肩袖撕裂病人SAB以修复过程为主，或者说是对机械刺激改变的反应，而不是炎症或破坏性过程。16 细胞数量和形态的变化还可能与肩峰下压力的增加有关。正常肩峰下存在压力，随着不同的活动范围而改变。肩峰下静息压力1.1kPa，肩主动前屈45°上升至5.2kPa［18］。肩袖撕裂的病人由于失去了肩袖对肱骨头的压力，肱骨头可不同程度的向上移位而导致肱骨头和肩峰之间的间隙缩窄；而且肩峰下往往形成骨赘，导致肩峰下间隙更加狭窄，SAB内压力必然会上升。因此作者推论肩袖撕裂时肩峰下压力包括SAB内的压力升高。从生物力学角度来说，生长和重建受应力之类的力学因素调节［19］，即应力(应变)决定着生长、重建，而形态又决定于其力学环境［20］。所以，肩袖撕裂病人的肩峰下存在广泛的反应，而且细胞形态变得狭长。　　本实验研究了肩袖撕裂病人SAB顶部的变化，证实SAB的变化系肩袖撕裂引起的继发反应，是一种反应性细胞数量的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。但是SAB底部的变化是否与顶部的变化一致，这正是作者下一步实验要解决的问题。【参考文献】［1］StevensonJH,TrojianT.Evaluationofshoulderpain［J］.JFamPract,2002,7:605-611.［2］LehmanC,CuomoF,KummerFJ,etal.Theincidenceof16 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