三氧化二砷诱导hep-2细胞凋亡及其对细胞周期各时相的影响

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1、三氧化二砷诱导Hep-2细胞凋亡及其对细胞周期各时相的影响【摘要】探讨三氧化二砷（As2O3）诱导Hep-2细胞凋亡机制及其对细胞周期各时相的影响。方法应用噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术法检测不同浓度的As2O3对Hep-2细胞的增殖抑制率，细胞周期改变及凋亡率，并通过电子显微镜观察其亚细胞结构改变。结果As2O3对Hep-2细胞增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，流式细胞术结果显示，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，电子显微镜结果显示，细胞空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集。结论As2O3对Hep-2细胞

2、有明显的增殖抑制作用，阻止G1期细胞向S期转化进程，诱导Hep-2细胞凋亡。【关键词】As2O3细胞周期凋亡Hep-2细胞近年研究结果证实，肿瘤的发生不仅与细胞增殖周期有关，且与凋亡亦有特殊的生物学意义［1］。因此，探讨细胞凋亡机制及发现新的凋亡诱导剂具有理论和实际意义，As2O3是中药砒霜的主要有效成分，作为药用已有2400多年的历史，20世纪70年代发现可有效治疗急性早幼粒细胞白血病，进一步的实验研究发现As2O3对其他恶性肿瘤也有作用［2］。本研究以Hep-2细胞为靶系统，体外探讨As2O3对细胞周期变化及其诱导凋亡作用，以

3、期为抗喉癌药物的筛选提供依据。61材料与方法1.1材料（1）As2O3为哈尔滨医科大学附属第一医院制备，以磷酸盐缓冲液配制成50μmol/L储存液，-20℃冰箱内保存备用。（2）Hep-2细胞（人喉癌细胞株）由吉林省肿瘤研究所提供。（3）RPMI1640培养基，MTT试剂为美国Sigma公司产品。1.2方法1.2.1MTT比色法取对数生长期的Hep-2细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，细胞数为2×106/ml，接种于96孔塑料培养板内每孔100μl，当细胞生长达到80%汇合时，每孔内分别加入不同浓度的As2O3溶液，0μm

4、ol/L、1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L，每个浓度6复孔，静止培养24h，于结束前6h加入MTT试剂20μl/孔，终浓度为500mg/L，继续培养6h加入酸化异丙醇50μl/孔，振荡5min，使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪于550nm波长处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率。Hep-2细胞抑制率=（1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值）×100%，结果见表1。1.2.2流式细胞术细胞培养及分组同MTT比色法，不同之处为将96孔培养板改为506ml培养瓶进行，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消

5、化收集细胞，PBS洗二次，70%冷乙醇固定，上机前过4S目网，调细胞数为1×106/ml，上机分析细胞周期的改变及细胞凋亡率，结果见表2。1.2.3透射电镜观察Hep-2细胞超微结构，细胞分组及培养条件同MTT比色法，收集经不同浓度As2O3作用的Hep-2细胞，离心弃上清，将沉淀于管底的Hep-2细胞用2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察，拍照，结果见图1，2。1.2.4统计学方法随机分组，组间比较用F检验，数据以均数±标准差（x±s）表示。表1不同浓度As2O3对Hep

6、-2细胞增殖抑制率2结果表1结果表明，不同浓度As2O3对Hep-2细胞增殖均有抑制作用，组间比较差异显著，Hep-2细胞增殖抑制率与As2O3浓度呈正相关（r=0.842）。表2As2O3对Hep-2细胞周期各时相影响及凋亡率表2结果表明，不同浓度的As2O3对Hep-2细胞周期均有影响，与对照组相比较差异均显著，随着药物浓度的上升，其抑制率亦上升，但是3μmol/L与5μmol/L相比，差异无统计学意义，但有上升趋势。图13μmol/LAs2O3对Hep-2亚细胞结构改变，细胞空化，线粒体肿胀（×5000）6图25μmol/L

7、As2O3对Hep-2亚细胞结构改变，细胞核破碎，可见凋亡小体（×5000）3讨论近年来，有关细胞周期调控机制及其与恶性肿瘤发生的关系研究进展较快，研究结果表明，化学结构不同，作用靶点各异的抗肿瘤药物，既可以阻滞细胞周期的进程，又可以诱导相应的细胞发生凋亡，而且能否诱导细胞凋亡已成为评价抗肿瘤药物疗效的重要标志［3］。本研究应用MTT比色法检测As2O3对Hep-2细胞的增殖抑制率，收到了满意的效果，结果显示，As2O3对Hep-2细胞抑制率呈剂量依赖性，抑制率为29%～52%，因为MTT试剂可被哺乳动物细胞线粒体中的脱氢酶还原成

8、蓝色甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系，该法是一种检测细胞存活的客观指标，广泛应用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验。流式细胞仪结果显示，不同浓度的As2O3对Hep-2细胞周期均有影响，与对照组相比差异均显著，但在组间比较