哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究

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1、哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究畜牧与饲料科学AnimalHusbandryandFeedScience2008,29(6):47—50哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究岳永明,裴利祥,王福强,赵贵(内蒙古鄂尔多斯市达拉特旗兽医局,内蒙古达拉特旗014300)摘要:综述了近年来国内外在哺乳动物卵母细胞采集方法,卵母细胞体外成熟培养技术的研究进展.对影响卵母细胞成熟的因素以及哺乳动物卵母细胞体外成熟在家畜育种中的应用进行了总结和分析.关键词:哺乳动物;卵母细胞;体外成熟中图

2、分类号:Q959.8;$814.6文献标识码:A文章顺序编号:1672—5190(2o08)O6—0047—04近年来,随着有关胚胎程技术的不断发展,对卵母细胞的需求El益增加,单纯依靠体内成熟的卵母细胞已经不能满足生产的需求,人们便把目光转向了卵母细胞的体外培养上来.通过采集屠宰哺乳动物卵巢上的原始卵母细胞,在体外模拟动物体内的环境下培养,直至卵母细胞成熟,并且能够与精子受精.目前,腔前卯母细胞在体外培养的成熟率已经取得突破性的进展,为哺乳动物胚胎_T程的研究和发展提供了坚实的基础.腔前卵泡的开发和应用是卵母细胞来源的重要途径,具有很大的开发价值科研工作

3、者在卵母细胞的体外成熟上做了大量的工作.可以通过体外培养使小鼠,绵羊,猴,猪,牛,人,山羊…,犬,马[3],大熊猫等哺乳动物的卵母细胞在体外获得成熟.随着卯母细胞体外成熟技术的不断提高,体外成熟的卵母细胞将广泛应用于体外受精,显微受精,核移植等胚胎工程的各个领域.到目前为止,卵母细胞的体外成熟研究已较成熟,人们通过在成熟液中添加血清㈣,卵泡液,雌激素,hCG,LHE等物质,使卵母细胞体外培养技术El益成熟完善.1卵母细胞的获取1.1卵母细胞的采集:卵母细胞的采集方法以及采集卵母细胞的部位和卵母细胞的发育状态都将影响到卵母细胞的体外成熟.1.1.1有腔卵泡卵

4、的获取:卵母细胞的成熟与卵泡的生长发育紧密相关,最初体外受精的研究主要集中在对卵巢有腔卵泡的利用上.有腔卵泡卵的主要来源有2个途径:第1种来源是活体卵巢,即活体取卵.其方法是用超声波扫描观察体内的卵泡发育状态,然后用吸卵设备吸取2～6mm的卯母细胞.它为充分的利用有价值的良种动物的卵母纽收稿日期:2008一l1—03作者简介:岳永明(1981一),男,助理兽医师,主要研究方向为动物疫病防治.胞及选择优质的卵子提供了方便,并且良种动物还可以继续繁殖.该法每周可取卵母细胞1～2次,连续几周,一般每次每头平均回收4～8枚卵母细胞.该法使得优良母畜得以持续利用,开

5、辟了良种化的新途径.第2种途径是采自屠宰场的废弃哺乳动物的卵巢,获取这种卵母细胞成本低廉,取材方便,能够满足胚胎体外大批量生产的需要.也是获得卵母细胞的最好途径.研究者一般是将废弃卵巢盛入20～30℃,含0.32mg/mL硫酸庆大霉素的生理盐水的保温瓶中,在6～8h运回实验室.将卵巢用含有0.32mg/mL硫酸庆大霉素的生理盐水洗净,然后进行采卵[63.用废弃卵巢采集卵母细胞一般采用机械分离法,郭宪等研究认为主要有以下几种方法:抽吸法,切剖法,剥离法.1.1.1.1抽吸法:用5mL或10mL的一次性注射器从直径2～8mm的卵泡中抽吸卵泡液(抽吸前注射器先吸

6、入少量的抽吸液),将抽取的液体注人灭菌试管中,沉淀5～10min.移去上清液倒出沉淀物检卯,或将抽出的液体直接注入检卵皿内,在体视镜下检卵.1.1.1.2切剖法:用手术刀片划破卵巢表面的卵泡,用5mL或10mL的一次性注射器吸取卵巢,用采卵液冲洗卵泡腔,将卯丘——卵母细胞的复合体(COCs)冲出,于实体显微镜下检卵].将切剖后的卵巢,去除黄体及多余的脂肪,从门部纵切卵为半,然后置于盛PBS+10Ixg/mL肝素的表面或者置于100mmxl5mm的培养皿中,用镊子固定卵巢,然后用单面刀或一组特制刀片(有3～5个单面刀片或双面刀片平行排列组成)进行纵横切割,去

7、除组织块,收集切割液,用漏斗冲洗过滤,检取COCs.1.1.1.3剥离法:用灭菌的眼科剪从卵巢上剪下完整的卯泡(6mm),放到加有2mL培养液的培养皿中,再切开卵泡,即可见到卵泡液自卵泡中流出,并带有卵母细胞,轻轻摇洗使颗粒细胞一并排出.48畜牧与饲料科学第29卷无论用何种方法进行收集,必须遵循一个原则:就是在最短的时间内获得最多的可用卵母细胞.抽吸法由于其操作方法迅速,一直是应用于牛,绵羊,山羊的～种主要的获取卵母细胞的技术.但是由于抽吸法使用针头的原因.易造成卵母细胞的损坏和丢失(25%～60%的回收率).Kruip等研究认为剥离法回收的卵母细胞多(9

8、0%).并且卵母细胞不受伤害,但操作时间太长.切割法和抽吸法较为常