实验十 猪胰蛋白酶1

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1、实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1.学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。2.学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶

2、易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键>酰胺键>肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰

3、蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸

4、铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。三、器材与试剂（一）器材1.新鲜或冰冻猪胰脏2.食品加工机和高速分散器23.研钵4.大玻璃漏斗5.小

5、塑料桶6.布氏漏斗7.抽滤瓶8.纱布9.恒温水浴10.紫外分光光度计11.秒表12.pH试纸（二）试剂1.pH4～4.5乙酸酸化水2.2.5MH2SO43.5MNaOH4.硫酸铵5.氯化钙6.2MNaOH7.0.8M，pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M硼酸溶液，加80ml0.2M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。8.0.4MpH9.0硼酸缓冲液（用“7”稀释1倍即可）9.0.2MpH8.0硼酸缓冲液：取70ml0.2M硼酸溶液，加30ml0.5M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。10.2MHCl11.0.01MHCl12.BAEE－0.

6、15MpH8.0Tris－HCl缓冲液（每毫升Tris缓冲液含0.11毫克BAEE和2.22毫克的氯化钙）四、实验步骤1.猪胰蛋白酶结晶步骤猪胰脏1.0公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入2倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5MH2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）

7、冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液，取样0.5ml后进行活化：慢慢加入研细的固体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使Ca2+与SO42-结合后，溶液中仍含有0.1MCaCl2，边加边搅拌，用5MNaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001MHCl稀释），测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5MH2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO42沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋白质含量，按242克/升加

8、入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼，滤液按250克/升加入研细的硫酸铵