实验六 胰蛋白酶结晶及活力测定

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1、实验一胰蛋白酶的结晶及活力测定原理胰蛋白酶（trypsin，EC.3.4.21.4）通常是以无活性的胰蛋白酶原（trypsinogen）形式存在于动物的胰脏中。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌到十二指肠后，在小肠上腔有钙离子的环境中被肠激酶（enterokinase）或胰蛋白酶所激活，其肽链N端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解而失去一个酸性6肽，分子构象发生改变，转变成有生物活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的Mr约为24000，其等电点为pH8.9。胰蛋白酶的的Mr为23400，等电点为pH10.8。胰蛋白酶在酸性条件下

2、稳定。通常在pH3.0的溶液内，在4的冰箱内储存数约乃至2年其活性无显著变化。当溶液的pH值小于2.5时，胰蛋白酶易变性；pH大于5.0时，容易发生自溶；在pH7.6~8.0时，其催化水解的活性最佳。重金属离子，有机磷化合物和某些反应产物均可抑制胰蛋白酶的活性。在胰脏、卵清和大豆中含有一些对胰蛋白酶活性具有抑制作用的天然抑制剂。胰蛋白酶催化水解蛋白质的能力，表现在它对碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度的专一性。此外，还能催化水解有碱性氨基酸所形成的酰胺键和酯键，胰蛋白酶对这些化学键催化水解

3、活性的敏感性依次是酯键＞酰胺键＞肽键。因此，可以利用含有这些化学键的人工合成的化合物为底物来研究胰蛋白酶的专一性催化活性。在动物的胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶的性质相似的蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）亦称糜蛋白酶，弹性蛋白酶(elastase)。在制备过程，采用常规的方法往往很难将三者彼此分离开。而采用具有高度专一性的亲合层析法可将它们分开。从胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH调至酸性（pH3.0左右），

4、使大量的酸性蛋白沉淀析出。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀，抽滤后的沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原也被激活。三种酶原激活相互作用过程如下：流程图7激活后的酶溶液，用硫酸铵分级盐析法初步将胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶分开，收集胰蛋白酶部分，通过结晶进一步纯化，使胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶通过离子交换层析可进一步分离。胰蛋白酶能水解酯键、酰胺键和肽键，根据这一性质，用人工合成的底物或天然的蛋白质（如酪蛋白）测定胰蛋白

5、酶的活性。目前，用于检测胰蛋白酶活性人工合成的底物主要是酰胺和酯两类。常用苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（enzoyl-argininep-nitro-anilide,简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酰-β-精氨酸乙酯(enzoyl-argininenaphthylamide,简称BANA)为底物测定酰胺酶的活力；用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（enzoyl-arginineethylester,简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（tosyl-L-argininemethylester，简称TAME）为底物测定酯酶的活力

6、。以BAEE为例，酶水解的反应如下：反应方程式以人工合成的底物测定胰蛋白酶活力时，通常采用紫外吸收法，酶活力单位的规定因底物及测定方法而异。操作方法一结晶胰蛋白酶的制备（一）胰蛋白酶原的提取1.称取1kg（净重）新鲜的或速冻的动物胰脏，剥去脂肪及接替组织。剪成小块，捣碎。2.加入2~2.5倍体积预冷的pH2.5~3.0乙酸酸化水，在5~10℃下提取6小时以上，并不时的的轻轻搅拌。3.用4层纱布挤滤，拧挤出滤液；组织残渣再加入约1/2体积（500ml左右）的乙酸酸化水，提取1~2小时。再次用纱布过滤。合并两次滤液，用2.5m

7、ol/L的硫酸调至pH2.5~3.0，静置约4小时，使提取液中的酸性蛋白承佃析出。4.用折叠滤纸过滤，收集全部的滤液，加入粉状固体的硫酸铵至0.75饱和度（按每1000ml滤液加492g，5℃）。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。5.用布氏漏斗抽滤，压紧成滤饼。即可获得胰蛋白酶原粗品。（二）胰蛋白酶原的激活1.将硫酸铵沉淀的胰蛋白酶原称重（湿重），加入约10倍体积的预冷蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解，一般情况滤饼中硫酸铵含量约站1/4。2.7用5mol/L氢氧化钠将溶液调至pH8.0，慢慢加入固体无水氯化钙使钙离子

8、的终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙和硫酸铵结合生成硫酸钙沉淀的钙离子）。随加随搅拌均匀。1.取出0.1ml溶液，稀释200倍测定激活前的蛋白含量及酶活性（一般情况下是无活性或活性极低）。2.加入2~5mg该种动物的胰蛋白酶为激活启动酶，轻轻搅匀，于4℃激活12~16小时或25℃激活3~4小