生化实验报告-胰蛋白酶活力测定

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1、实验胰蛋白酶活力测定一、原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。二、实验仪器试管7220分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂1.福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2.0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至10

2、00ml3.10%三氯乙酸溶液4.0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5.0.5%酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。6.500ug/L酪氨酸溶液7.胰蛋白酶溶液四、实验步骤v标准曲线的制作：按下表加入试剂：管号123456500ug/L酪氨酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20v各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三

3、氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，测OD680。v以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂管号12备注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中酶解15分钟0.2mol/L磷酸缓冲液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0过滤上清液1137水浴中显色15分钟0.55mol/L碳酸钠溶液5.05.0福林试剂B11OD68000 管号1234567（样品）酪氨酸

4、微克数00.10.20.30.40.5-----------OD68000.1560.2520.3730.4990.5840.873OD68000.1580.2530.3740.5010.5850.875OD68000.1590.2550.3750.5030.5860.877OD680(平均)00.1580.2530.3740.5010.5850.875五、结果计算由上表可作出标准曲线如下：由上可知，样品的吸光度y=0.875，则x=0.7336μg，即A=0.7336μg故根据公式样品中含酶活力单位=A/15╳FA—样品测定

5、光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.7336/15╳13=0.6358六、实验分析1.测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。2.胰蛋白酶的最适PH值多少?PH值对胰蛋白酶稳定性有何影响?答：胰蛋白酶的最适PH值为8.1。胰蛋白酶的活性在一定的PH值范围内随着PH值的升高而升高，超过最适的PH值时酶活性降低。