人骨形态发生蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达！

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1、中国生物工程杂志&:>@?+>CRGD:@C=CAH，(""8，(8（#）：<7K<8""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""人骨形态发生蛋白!（"#$%!）在巴斯德毕赤酵母中的表达!梁东春左爱军王宝利郭刚张镜宇!!（天津市内分泌研究所天津!"""#"）摘要以重组质粒$%&’!"#(为模板)&*扩增人+,)’(成熟肽编码序列，将该序列克隆入$-.,’/载体进行012序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体$)3&45中。重组质粒$)3&45’!"#(经!$%33酶切后回

2、收线性化片段，聚乙二醇法转染毕赤酵母菌株-6778。)&*筛选整合有人+,)’(基因的酵母细胞重组子，以甲醇进行诱导表达，于酵母细胞培养基中可检测到9:+,)’(。体外培养条件下，所得9:+,)’(可增加(/!小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性；体内实验，9:+,)’(冻干粉可于小鼠骨四头肌肌袋中诱导软骨细胞群产生。关键词人骨形态发生蛋白(（+,)’(）毕赤酵母分泌表达人骨形态发生蛋白’(（:+,)’(）不但具有良好的的重组质粒$%&’!"#’(，大肠杆菌菌株P,7"4、(/!诱导成骨活性，可作为成骨因子应用于骨组织工程小鼠成骨细胞系为本实验室保存。酵母表达

3、质粒［7K8］领域，还是7种重要的发育调节因子。基因工程$)3&45，酵母菌株-6778购自3@Q>R9CAG@公司。克隆生产重组人+,)’(（9:+,)’(）无论在临床应用还是载体$-.,’/购自)9CJGA?公司。基础研究中都具有重要的意义。由于大肠杆菌无法7O7O(酶和试剂012限制性内切酶/(-3，进行某些真核蛋白活性所必需的翻译后加工，重组0’-13，!$%33，/;012S>A?TG购自/?5?*?大连有限蛋白又往往以不溶的形式出现在包涵体中。若选用公司，去糖基化酶)1-?TGN购自+>C=?UT公司。抗大肠杆菌表达系统，必须对包涵体进行后

4、期处理才坏血酸（2TDC9U>D?D>B）购自6>AJ?公司。+&2蛋白能获得有生物活性的9:+,)’(。本实验室曾在昆虫浓度测定试剂盒购自)>G9DG公司，碱性磷酸酶测定细胞及中国仓鼠卵巢细胞（&LMDG==）这两种真核细试剂盒为天津市药物研究院产品。小鼠抗人+,)’［<］胞中成功表达出了直接具成骨活性的9:+,)’(，但(单克隆抗体购自美国*V0公司，L*)标记的羊上述表达系统大规模培养困难，不适于产业化生产。抗小鼠3A-购自北京中山生物技术有限公司。所毕赤酵母（#&’(&)*)+,-.&+）表达系统一方面具有原核需引物自行设计，由上海生工生物技术

5、公司合成。系统操作简便、细胞生长迅速、能大规模发酵生产的&’!方法优点。另一方面其对蛋白质的翻译后加工方式也接7O(O7重组质粒$-.,’!"#’(的构建以本室前近于哺乳动物细胞，已用于9:/1N、9:.-N等多种重期构建的重组质粒$%&’!"#’(为模板进行)&*，所［#］组蛋白的批量生产，本文尝试以该系统进行了用引物为TG@TG8W’?DRDA?A????A?D?RA?RAA????AAA’!W；9:+,)’(的表达。?@R>TG@TG8W’ADA??RRDDR?ADA?D?DDD’!W。上游引物中引入了限制性内切酶/(-3识别位点及毕赤酵母分泌型

6、&材料与方法表达所必需的信号肽编码序列；下游引物含限制性&’&材料内切酶0’-13的识别位点。)&*反应条件为48X预7O7O7菌株和质粒含人+,)’(成熟肽编码序列变性8J>@；4;X，!"T；<(X，!"T；#(X，!"T，!"个循环；#(X最终延伸8J>@。7O8Y琼脂糖凝胶电泳回收收稿日期：("";’7(’("修回日期：(""8’"<’"!)&*产物与$-.,’/载体进行连接，连接产物转化!天津市自然科学基金重点项目（"(!7"8!77）!!通讯作者，电子信箱：=>?@ABC@AD:E@7((FGHCEIDCJ感受态细胞大肠杆菌P,7"4。酶切

7、鉴定筛选阳性重P)中国生物工程杂志3+?=S,?A@CN+=ADABMUADc)9"AcZ)779组质粒，进行!"#序列分析（所用引物为$%&’）。次。收集细胞裂解液，测定其中碱性磷酸酶（#]-）%()()*+,$-.)酵母表达重组子的构建以限制活性，,3#法测定每个样本的总蛋白浓度对#]-性内切酶!"#/和$%#&/分别处理重组质粒012$.结果进行矫正。（)）体内包埋表达产物对蒸馏水’().)及酵母表达质粒0-/345，电泳回收所需透析RF+后进行冷冻抽干。取冻干粉%(7GB植入!"#片段进行连接，连接产物转化感受态细胞大小鼠股四头肌肌袋中，植入%

8、(7GB,E#作为对照。肠杆菌6$%74，-38筛选重组质粒0-/345.’().)。)%K后