经改造的猪IGF-I基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

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1、农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):217~221·研究论文·经改造的猪基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达*123214陈苗, 伍晓雄**, 商汉桥, 戴汉川, 刘红林, 李奎(1.南京农业大学动物科技学院，南京210095；2.华中农业大学动物医学院，武汉430070；3.华中农业大学水产学院，武汉430070；4.中国农业科学院畜牧研究所，北京100094)摘要:采用酵母偏爱密码子合成5条编码猪胰岛素样生长因子玉（）基因的引物，利用重叠P

2、CR技术获得含210bp猪IGF玉成熟蛋白基因的拼接产物。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌（）。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDSPAGE检测表达产物，在7.5kD处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dotblot检测表明，重组蛋白可与抗IGFI多克隆抗体反应。关键词:猪胰岛素样生长因子玉；酵母偏爱密码子；毕赤酵母；分泌表达中图分类号：S188文献标识码：A 文章编号：10061304(2007)02

3、021705SecretoryExpressionofReconstructedPorcineInsulinlikeGrowthFactorIinCHENMiao 1,WUXiaoxiong 2**,SHANGHanqiao 3,DAIHanchuan 2,LIUHonglin 1,LIKui 4Fiveprimersweresynthesizedusingyeastbiasedcodons,andaproductincluding210bpDNAfragmentofmaturepeptideofporcin

4、einsulinlikegrowthfactor玉()wasamplifiedbyOverLapExtensionPCR.ThefragmentwastheninsertedintopPIC9Kvector,withtheinsertbeingdownstreamregionsofpromoterandαsecretingsignalpeptide.Theplasmidwasdigestedwith玉andtransformedintoHIS4mutant GS115strainbyLiCl.Thepheno

5、typesofcolonieswereidentifiedbycomparisonofthegrowthperformanceonMMandMDplates.TwocoloniesT1andT2wereselectedfrom4.0mg/mLG418plates,followedbyinductionofpIGFIexpressionwith1.5%methanol.SDSPAGEanalysisofsupernatantofthe GS115strainrevealedanexogenousproteinw

6、ithmolecularweightofapproximately7.5kD.DotblothybridizationassayindicatedaspecificreactionwithrabbitpolyclonalantibodyagainsttheIGF玉protein.TheoptimalcultureconditionofT2wasachieved,and410mg/Loffluidculturewasproducedin strain. porcineinsulinlikegrowthfacto

7、rI;yeastbiasedcodons; ;secretoryexpression胰岛素样生长因子玉(IGF玉)是胰岛素家族，1992）。此外，IGFI与糖尿病（Dunger.，的主要成员，影响多种细胞的增殖、分化、代谢及存2003）、心脏病（Hayati，2004）等疾病之间的联活，在基础研究及临床疾病治疗方面具有广阔的应系，正越来越受到人们的重视。用前景。IGFI由70个氨基酸组成，分子量7.5kD，采用真核表达系统表达蛋白具有重组蛋白生物由肝脏、子宫、软骨等多种组织分泌，可影响胚胎的活性高、折叠正确及

8、易于纯化的优点，已用于多种重发育（Makarevich .，2000），骨骼的生长与修复组蛋白的表达研究中(Gellissen .,2005)。然而由（Madry .，2005），并可提高动物泌乳量（Prosser于酵母具有密码子偏爱性，某些外源基因的表达量.，1990）。注射IGFI可提高小鼠肌肉组织对葡并不高(Chang , 2006;Gustafsson ,2004; 萄糖的利用率，增加了肌肉