金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马ca1区神经元细胞凋亡的影响论文

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1、金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马CA1区神经元细胞凋亡的影响论文马飞煜王凤王虎田贤先张昱【摘要】目的研究金属硫蛋白3(MT3)对快速老化痴呆模型小鼠(SAMP8)海马CA1区神经元细胞凋亡的影响及其机制。方法将7月龄SAMP8小鼠随机分成6组，分为痴呆组、3种浓度的MT3组、MT1组、空白对照组。快速老化小鼠对照(SAMR1)小鼠为正常对照组。连续腹腔注射28d后灌注取脑，进行海马CA1区原位末端标记(Tunel)试剂盒和免疫组化(SP)试剂盒染色。结果痴呆组海马CA区神经元细胞凋亡指数明显高于正常对照组。高浓度MT3组凋亡指数最低，Bcl2蛋白表达增强

2、，Bax蛋白表达最低(P＜0.01，P＜0.05)。MT3组对Bax蛋白表达的抑制作用强于MT1对照组，而二组对Bcl2蛋白表达的差异不显著。结论SAMP8小鼠海马结构存在大量神经元细胞凋亡，MT3通过减少Bax表达和增加Bcl2表达.freelageproplus图像分析系统(日本)。1.2实验动物分组选择雄性SAMP8小鼠60只，7月龄，体重25～30g，随机分成6组：空白对照组(生理盐水)、低(1.5mg·kg-1·d-1)、中(3mg·kg-1·d-1)、高(6mg·kg-1·d-1)浓度MT3组、MT1对照组(3mg·kg-1·d-1)和痴呆组。

3、另将雄性SAMR1小鼠10只，7月龄，体重30～40g，为正常对照组。天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。1.3方法连续28d腹腔注射给药，停药1d后将各组小鼠用4%多聚甲醛灌注取脑，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋制成蜡块，每只鼠海马连续发4～5μm片，备Tunel和免疫组化(SP)法使用。1.3.1Tunel实验方法①石蜡切片脱蜡和脱水；②用4%多聚甲醛固定；③100μl新配制的蛋白酶K工作溶液消化；④再置于4%多聚甲醛溶液固定；⑤加100μl平衡液缓冲，室温平衡5～10min；⑥滴加50μlTdT酶反应液；再加入50μl2×SSC溶液终

4、止反应；⑦用0.3%的H2O2浸洗；⑧滴加100μl稀释的链酶亲和素过氧化物酶(StreptavidinHRP)溶液；⑨DAB显色剂加至标本片上；⑩去离子水漂洗；梯度乙醇浸洗；二甲苯浸洗固定，树脂封片。阴性对照在操作步骤⑥所用到的反应液中不添加TdT酶，其余与实验组步骤相同。1.3.2SP分析①石蜡切片脱蜡和脱水；②1%H2O2灭活内源性过氧化物酶；③枸橼酸盐缓冲液修复抗原；④正常山羊血清封闭非特异性抗原；⑤滴加特异性一抗(兔抗鼠Bas多克隆抗体或兔抗鼠Bcl2多克隆抗体)；⑥生物素化羊抗兔(IgG/Biotin)；⑦滴加StreptavidinHRP溶

5、液；⑧DAB显色；⑨苏木精复染，中性树脂封片。对照用聚丁二酸丁二醇酯PBS代替一抗作阴性对照。1.4图像分析及统计学分析在光镜下进行观察，每张切片随机选取20个高倍(×400)视野，计数细胞，计算凋亡百分率，即凋亡指数(AI)，计算公式如下：AI＝(阳性细胞数/总细胞数)×100%。数据以x±s表示，用SPSS10.0统计软件，进行方差检验和t检验。2结果2.1各组小鼠海马CA1区神经元的AI①正常对照组罕见凋亡细胞，AI为(5.6±1.1)%；②痴呆组海马CA1区可见大量凋亡细胞，AI分别为(38.8±3.1)%，与正常对照组相比，差异显著(P＜0.01)。③

6、低、中、高浓度MT3组的小鼠海马CA1区AI依次为(23.4±3.6)%、(20.1±4.5)%、(15.7±3.9)%，高浓度MT3组凋亡指数最低；与空白对照组AI相比，差异显著(P＜0.05)。④相同浓度MT3和MT1对照组小鼠海马CA1的AI分别为(20.1±4.5)％、(21.6±3.8)％，组间差异不显著。2.2Bcl2蛋白在各组小鼠海马CA1区神经元中的表达①Bcl2蛋白在正常对照组组海马神经元中表达较强，IOD值较高；而在痴呆组海马神经元中表达弱，IOD值低，两组间差异显著(P＜0.05)。②3种浓度MT3组相比，Bcl2蛋白在高浓度MT3海马神

7、经元中表达增强，但无统计学意义；分别与空白对照组比较，高浓度组Bcl2蛋白表达明显增强，IOD值明显增高(P＜0.05)。③Bcl2蛋白在MT3与MT1两组间表达差异不显著。见表1。2.3Bax蛋白在各组小鼠海马CA1区神经元的表达①Bax蛋白在正常对照组小鼠海马CA1区神经元表达弱，IOD值低；而在痴呆组小鼠海马神经元表达强，IOD值高，两组间差异显著(P＜0.05)。②高浓度MT3组IOD值是3种浓度组最低，差异显著(P＜0.05)；分别与对照组相比高、中浓度MT3组Bax蛋白表达显著减弱，IOD值明显降低(P＜0.05)。③Bax蛋白表达在MT3组明显

8、低于MT1组(P＜0.0