黄连解毒汤对快速老化模型小鼠海马蛋白表达作用的研究

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硬士学位论文缩略语蹇ADAK4APPABBWCDCREI，lCHAPSDSSDTrGlsynGSTHUDThIIRNPHRPmFIPGUⅣJAK．2～LULDl．TOF-MShf、)订讧NFTs．N^虹)APAGEP～【FPSDSAMSAⅣm8SAMRlSDSSPTEMEDAlzhtimer’sdiseascadenylatekillase4amyloidprecursorproteinp栅yloidproteinBawdDihuangdecoctioncell-division-control-relatedproteinl3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]一1-propanesulfomateDaagguiShaoyaoSanDL-Dithiothreitol宙utaminesynthetasegtutathioneS-transferaseHuanlian-Jie-Du-Tangheterogeneousnuclearribonucicoprotcinhorseradishperoxidasoisoeleetricfocusingimmobilizedp8gradientLiuwciDihuangdecoctiontyrosine，proteinkinase2Matrix-assistedLaserDesorptionIon／zat／onTuneofFlightMassSpectromotryMorrisWatorMazeneurofibrillarytangleN-methyl-D·asparatepolyacrylamidegelpeptidemassfmgorprin"tmgPostsynapticdensityproteinSenescence-acceleratedmouscSAM-prone／8SAM-resistant／lsodiurndodecylsulfatesenileplaqueN，N，N’'N’-teramethyl-ethylenediamine阿尔茨海默病腺苷酸激酶4淀粉样前体蛋白B淀粉样蛋白八味地黄汤细胞分裂调控相关蛋白丙基硫酸盐当归芍药散二硫苏糖醇谷氨酰胺合成酶谷胱苷肽．s．转移酶黄连解毒汤不均一核内核糖核蛋白辣根过氧化物酶等电聚焦固相讯梯度六味地黄汤酪氨酸蛋白激酶2基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱Morris水迷宫神经纤维缠结N．甲基．D．天门冬氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳肽质量指纹谱突触后密度蛋白快速老化模型小鼠快速老化模型小鼠P8亚系抗快速老化模型小鼠Rl亚系十二烷基硫酸钠老年斑N'NN’'N’．四甲基乙二胺兰：里曼垒鲨：垡i婴竺!i!璺型璺宝!业翌坐銎皂皇茎 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得至主堕鲎叠茔瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字：埠签字日期：—埠年—￡月三上日军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解星主匡鲎盘堂瞳有关保留、使用学位论文的规定。特授权芏奎匡堂盘鲎瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。(保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字：釜鸩签字目期：2塑2年—』月三L日指导教师签字：』缴签字日期：塑2年—￡月卫日 硕士学位论文中文摘要黄连解毒汤对快速老化模型小鼠海马蛋白表达作用的研究(中文摘要)学位申请人姓名：申请学位门类和级别：指导教师：专业名称：年级：培养单位：王杉学号：041132医学硕士周文霞研究员张永祥研究员药理学专业代码：1007062004级军事医学科学院毒物药物研究所随着人口老龄化，阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease,AD)已成为严重危害人类健康的四大杀手疾病之一。由于AD发病机制十分复杂，病因至今不明，亦无理想的防治药物问世，因此，给其防治带来了很大的困难。而越来越多的研究提示，AD的发生发展过程涉及多系统、多环节结构和功能的异常，是典型的多因素复杂疾病，针对单一靶点的防治措施难以取得满意疗效，多靶点综合干预是提高AD防治水平的重要策略。因此，寻找、研究并确立一组或几组与AD脑内病理改变及认知功能障碍密切相关的、且具有相互补充与协同关系的“组合靶标”，将为AD防治药物的筛选和发现提供新的筛选靶标体系，将大大提高AD防治药物的研究和开发水平。中药，尤其是中药复方在防治AD中显示出明显特色和优势。有资料显示，我国和日本等国家在防治AD的临床实践中均广泛使用了多种中药复方，取得了明显疗效。目前普遍认为，中药复方的药效是由方中所含的多种药效成分，通过多途径、多环节和多靶点作用而产生的综合效果，从这一点上看，中药复方对于防治AD这类多因素复杂疾病而言，与作用靶点相对单一的化学药物相比具有明显的优势和特色。事实上，我国和日本等国家在防治AD中广泛使用的中药复方如当归芍药散、开心敖、六味地黄汤、八味地黄汤、黄连解毒汤、调心方、钩藤散等，不但在治疗AD方面取得良好的临床疗效，实验药理学研究结果也表明这些中药复方对于AD或学习记忆功能障碍模型动物的学习记忆功能具有改善作用，提示它们发挥抗AD作用是具有一定药理学基础的。从中医药分类看，这些中药复方的功能主治不尽相同，如补肾、活血化瘀、清热解毒等，提示它们发挥药效的靶点和作用机理可能有所不同。因此，从这些中药中选择几种疗效明确的代表方剂做为工具，研究和探索它们发挥益智作用的环节或靶2 硕士学位论文中文摘要点有望为防治AD药物筛选与研究新靶标的发现提供线索，同时还可能为从药理学角度研究和阐述AD病理生理学过程和发病机制提供新的线索。基于上述原因，本实验室在国家重点基础研究发展规划项目的资助下，选择包括六味地黄汤、八味地黄汤、当归芍药散、调心方及黄连解毒汤在内的几种功能主治不同的中药复方作为工具药物，以与AD具有相似病理特点的快速老化模型小鼠(seneseenee-acmleratedmouse，SAM)P8亚系(SAMP8)为模型，通过实验治疗并结合抑制消减杂交、基因芯片和蛋白质组学等技术方法从与学习记忆或认知功能密切相关的脑区寻找药物反应基因和蛋白，旨在通过分析与比较，确定上述中药复方发挥抗AD作用的主要环节或靶点，并据此提出并通过验证确定一组或几组AD防治药物筛选和评价的“组合靶标”，为新型抗AD药物筛选和评价体系的建立奠定基础。本文是上述研究的重要组成部分。其主要研究内容在于，首先应用学习记忆行为实验初步验证清热解毒方剂黄连解毒汤对SAMP8学习记忆能力的改善作用，进而应用蛋白质组学技术，观察黄连解毒汤作用下海马这一与AD病理变化及学习记忆损害密切相关脑区蛋白表达的变化，并通过对其中的差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析，初步获得海马中的黄连解毒汤反应蛋白，为揭示黄连解毒汤作用环节或作用靶点提供依据。同时通过与六味地黄汤、八味地黄汤和当归芍药散进行分析与比较，获德黄连解毒汤与这三个方剂的共同反应蛋白和各自特异性的反应蛋白，为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的提出和后续的靶标验证工作提供线索。一、黄连解毒汤对12月龄SAMP8学习记忆行为的影响SAM包括快速老化的P系(SAM-prone,SAMP)和R系(SAM-resistant,SAMR)两大系。其中SAMP8亚系的显著特征是中枢学习记忆功能随增龄快速衰退，其脑内具有多种与AD相似的病理变化如APP代谢异常及D淀粉样蛋白含量的升高等，且其对药物治疗具有良好的反应，因此被认为是研究AD发生机理及其防治药物的较为理想的动物模型。SAMRl亚系有着相对正常的生存期，常被用做正常对照。本研究以SAMP8作为学习记忆障碍模型，通过Morris水迷宫实验和跳台实验观察了黄连解毒汤(HLJDT)对SAMP8空间学习记忆能力和被动回避能力的影响。Morris水迷宫实验结果表明，与同龄SAMRl相比，SAMP8在定位航行实验中的逃避潜伏期明显延长，空间探索实验中的目标穿环次数明显下降，灌胃给予HLJDT(2．5g／kg)， 硕士学位论文中文摘要连续2个月，可明显缩短SAMP8的逃避潜伏期，并且可明显提高目标穿环次数。跳台实验结果表明，训练期间SAMP8逃避电击成功率低于SAMRl，灌胃给予HLJDT后，提高了SAMP8逃避电击成功率；测试阶段SAMP8的跳台错误次数高于SAMRI，灌胃给予HLJDT后跳台错误次数明显下降。结果提示SAMP8被动回避反应能力降低，HI肛)T对其具有一定的改善作用。二、黄连解毒汤对12月龄SAMP8海马蛋白表达的影响(—)12月龄SAMRl和SAMP8海马差异蛋白的分离和鉴定1SAMRl和SAMP8海马蛋白表达谱的建立及差异分析首先采用双向凝胶电泳结合图像分析技术观察12月龄SAMRl和SAMP8的海马蛋白表达谱，结果表明，与SAMRl相比，SAMP8海马中表达存在明显差异的蛋白点有29个，其中8个蛋白点显著上调，21个蛋白点显著下调。2SAMRI和SAMP8海马差异蛋白的质谱鉴定及生物信息学分析选取上述差异蛋白点中的15个，经胶内酶切、MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹谱、Mascot数据库查询进行蛋白鉴定，结果表明这15个蛋白点对应15个蛋白，且均为已知功能蛋白，其中有3个蛋白在SAMP8中表达显著上调，12个蛋白表达显著下调。利用公共数据库对上述15个差异蛋白的功能及相关信息进行检索，结果表明，这些蛋白功能可分为以下8类：(1)能量代谢相关蛋白3个，分别是腺苷酸激酶4、a异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶(eP旷传递体，线粒体Fo复合体亚基d)：(2)蛋白合成降解相关蛋白3个，分别是蛋白酶体阱、泛素结合酶E和肽酰脯胺酰胺顺反式异构酶：(3)信号转导相关蛋白1个，为突触后密度蛋白95；(4)转录调控相关蛋白1个，即不均一核内核糖核蛋白H2：(5)核苷酸代谢相关蛋白2个，分别为核苷二磷酸激酶2和53，核苷酸酶；(6)细胞骨架蛋白2个，分别是Stathminl蛋白和B微管蛋白：(7)细胞周期相关蛋白2个，分别是髓细胞性白血病因子2和CDCREL-I(CDCrel．1，cell-division-control-relatedprotein1，细胞分裂调控相关蛋白)；(8)其它蛋白1个，为Ⅵllin2(绒毛蛋白2)。其中不均一核内核糖核蛋白K、腺苷酸激酶4和p微管蛋白3个蛋白在SAMP8中表达上调；其它蛋白，包括n异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶、突触后密度蛋白95、Stathmm蛋白、蛋白酶体乳、肽酰脯胺酰胺顺反式异构酶、泛素结合酶E、CDCrel．1和Villin2等在SAMP8海马中表达下调。4 硕士学位论文中文摘要(二)黄连解毒汤对SAMP8海马蛋白表达的影响1黄连解毒汤对SAMP8海马蛋白表达谱的影响及差异分析采用双向凝胶电泳结合图像分析技术观察了连续灌胃给予2．5g／kgHI．JDT2个月后SAMP8海马蛋白表达谱的变化。结果表明，与SAMP8对照组比较，给予HUDT后SAMP8海马中出现明显差异表达的蛋白点共有38个，其中18个蛋白点表达显著上调，20个蛋白点表达显著下调。2黄连解毒汤反应蛋白点的质谱鉴定及生物信息学分析选取14个给予HI．JDT后表达水平具有明显变化的蛋白点经胶内酶切、MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹谱、Mascot数据库查询进行蛋白鉴定，结果有13个蛋白点鉴定获得了肽质量指纹谱，数据库查询表明它们对应13个蛋白，其中11个蛋白为已知功能蛋白，2个为未知功能蛋白。11个已知功能蛋自中，有5个蛋白在给予HLIDT的SAMP8海马中表达显著上调，7个表达显著下调；2个未知功能蛋白给予HLIDT后表达均下调。利用公共数据库对已知蛋白的功能及相关信息进行了检索，结果表明，上述13个具有明确功能的蛋白可分为以下5类：(1)能量代谢相关蛋白6个，分别是a异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶(旷传递体，线粒体Fo复合体，噩基d)、腺苷酸激酶4、醛缩酶C、碥醇酶和磷酸甘油酸变位酶；(2)转录调控相关蛋白1个，为不均一核内核糖核蛋白H2；(3)细胞骨架蛋白1个，为s诅lhminl蛋白；(4)氨基酸代谢相关蛋白1个，为谷氨酰胺合成酶；(5)细胞周期相关蛋tt2个，分别是septin11和髓细胞性白血病因子2。其中a异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶、腺苷酸激酶4、Stathmin1蛋白及髓细胞性白血病因子2共5个蛋白，它们在灌胃给予HLIDT后的SAMP8海马中表达上调；醛缩酶C、旺烯醇酶、不均一核内核糖核蛋白H2、septin11、谷氨酰胺合成酶和磷酸甘油酸交位酶l共6个蛋白在给予HLJDT的SAMP8海马中表达下调。此外，另有两个未获功能的蛋白，分别是未命名蛋白1和未命名蛋白2，它们在给予HLJDT后在SAMP8海马中表达均下调。三、黄连解毒汤与六味地黄汤、八味地黄汤和当归芍药散对SAMP8海马蛋白表达影响的比较5 硕士学位论文中文摘要本室前期已对六味地黄汤(LW)、八味地黄汤(Bw)和当归芍药散(DSS)对SAMP8海马蛋白表达的影响进行了研究，获得了给予这些方剂后在SAMP8海马中表达有变化的蛋白，我们暂称之为方剂“反应蛋白”。在本研究中，我们将它们与HUD下的反应蛋白进行了生物信息学分析与比较，旨在从这四个方剂中寻找它们的共同反应蛋白和各自特异的反应蛋白，以期为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的提出和后续的靶标验证工作提供线索。(一)四方剂的共同反应蛋白对12月龄SAMP8分别给予LW、BW、DSS及HLIDT后获得的差异蛋白及药物反应蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析，并进行比较，得到四方剂的共同反应蛋白共计14个，按功能可分为以下7类，(1)能量代谢相关蛋白6个，分别是磷酸甘油酸变位酶l、烯醇酶l、醛缩酶C、a异柠檬酸脱氢酶、线粒体顺乌头酸酶2和焦磷酸酶；(2)线粒体代谢相关蛋白2个，分别是a丙酮酸脱氢酶和还原型辅酶I．辅酶Q氧化还原酶；(3)信号转导相关蛋白2个，分别是电压依赖性阴离子通道2和酪氨酸蛋白激酶2；(4)神经元凋亡相关蛋白1个，3．巯基丙酮酸硫基转移酶；(5)转录调控相关蛋白1个，不均一核内核糖核蛋白H2。(6)细胞周期相关蛋白1个，septin11蛋白。(7)蛋白合成分解相关蛋白1个，磷脂酰肌醇转移蛋白。(--)四方剂特异性的反应蛋白上述四个方剂除了共同的反应蛋白之外，还有其特异性的反应蛋白。其中HLJDT特异性的反应蛋白点按其功能可以分为以下5类：(1)氨基酸代谢相关蛋白，为谷氨酰胺合成酶；(2>能量代谢相关蛋白，为ATP合酶；(3)细胞骨架相关蛋白，为Stathmin蛋白；(4)细胞周期相关蛋白1个，髓细胞性白血病因子2；(5)其它蛋白，包括未命名蛋白l和未命名蛋白2。BW特异性的反应蛋白为13伴侣素，属于热休克蛋白类。DSS特异性药物反应蛋白按功能可以分为以下4类：(1)线粒体功能相关蛋白，包括醛脱氢酶、乙醛还原酶、丙酮酸脱氢酶和谷胱甘肽S转移酶；(2)能量代谢相关蛋白，包括腺苷酸激酶和磷酸丙糖异构酶；0)信号转导相关蛋白，包括肌动蛋白结合蛋白；(4)蛋白降解相关蛋白，泛素羧端水解酶L1；(5)细胞骨架蛋白，fascin蛋白。从LW、BW、DSS和HLJDT对SAMP8海马蛋白表达影响的比较可以看出，这四个方剂既有共同的方剂反应蛋fl(14个)，也有各方剂特异的反应蛋白。各方剂特异6 硕上学位论文中文摘要性的反应蛋白可能与它们有不同的作用靶点、作用性质和作用机理有关。而各方剂的共同反应蛋白一方面提示它们可能是与AD发生或学习记忆衰退有关的潜在病理相关蛋白，另一方面提示它们也可能是四方荆防治AD过程中存在的共同或关键作用环节或靶点，有望成为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的组成部分。四、蛋白免疫印迹对部分差异蛋白的验证为了验证采用双向电泳技术结合质谱鉴定所获得的差异蛋白的准确性，本研究选择蛋白免疫印迹实验对差异蛋白的表达进行了验证。根据差异蛋白的功能提示，选择了醛缩酶3，C异构体和还原型辅酶I-辅酶Q氧化还原酶，谷胱苷肽．S-转移酶，谷氨酰胺合成酶，酪氨酸蛋白激酶2共5个蛋白进行验证。双向电泳结合质谱鉴定结果表明，与同龄SAMRl相比，醛缩酶3和C异构体蛋白在SAMP8海马中表达显著上调，给予DSS或HLIDT后它们的表达水平明显下调，给予BW后它们的表达水平有下调趋势：酪氨酸蛋白激酶2在SAMP8海马中表达也显著上调，而给予LW或BW后其表达水平明显下调。双向电泳结合质谱鉴定结果还显示，谷胱甘肽．s．转移酶蛋自在SAMP8海马中表达下调，给予DSS和BW后其表达水平明显上调。此外，还原型辅酶I．辅酶Q氧化还原酶蛋白在SAMP8海马中表达有下调趋势，给予LW和HLIDT后其表达水平上调，但给予BW、DSS后其表达水平进一步下调。谷氨酰胺合成酶在SAMP8海马中表达有上调趋势，给予HLIDT后其表达水平显著下调。蛋白免疫印迹实验结果表明，这5个蛋白的表达情况与双向电泳实验的结果基本一致，提示采用双向电泳结合质谱分离鉴定差异蛋白获得的结果基本可靠。五、腺苷酸激酶4(AK4)在SAM海马中表达的动态变化情况SAM海马蛋白的双向电泳结合质谱鉴定的结果表明，腺营酸激酶4(adenylatekinaso4．AK4)在2、6及12月龄SAMRl海马中均未见表达，而在各个月龄SAMP8海马中呈高表达，提示AK4可能与老化的发生密切相关。因此，本研究应用免疫印迹实验，进一步观察了AK4在2、6、12及18月龄SAMP8海马中的动态变化情况，并与同龄SAMRI进行了比较。结果显示，AK4在2．18月龄SAMP8中呈高表达，且随增龄其表达水平有逐步升高的趋势，与此相反，其在SAMRl海马中的表达仅出现于18月龄时，且表达非常微弱，其余月龄SAMRl均未见表达。初步提示AK4可能是一个与老化相关的蛋白，值得进一步深入研究。7 硕士学位论文中文摘要通过以上研究，本论文得到以下结论：1．与同龄SAMRl相比，SAMP8空间学习记忆功能明显下降，被动回避反应能力降低，灌胃给予HI_JDT可明显提高SAMP8的空间学习记忆能力，对其被动回避反应能力也有一定改善作用，说明HLIDT具有益智作用。2．12月龄SAMP8和SAMRl海马中有29个差异蛋白点，经质谱鉴定，共鉴定出15个蛋白，均为已知功能蛋白，它们的功能涉及能量代谢、蛋白合成降解、细胞骨架组成、信号转导等。上述差异蛋白可能与SAMP8学习记忆功能障碍有关，可为SAMP8脑老化机制或防治AD药物靶标的研究提供线索。3．灌胃给予HLIDT2个月后SAMP8海马蛋白表达变化的蛋白点有38个，选择其中14个点进行质谱鉴定，鉴定出13个，其中5个蛋白在给予HI．3DT后表达显著上调，8个蛋白给予HuDT后表达显著下调。结果说明HLJDT对$AMP8海马蛋白的表达具有调节作用，对这些蛋白的功能进行分析和研究有望为揭示HLJDT作用机理乃至发现抗AD药物作用新靶标提供线索。4．比较六味地黄汤、八味地黄汤、当归芍药散及黄连解毒汤这四个临床和实验药理学均证明可有效防治AD的方剂对SAMP8海马蛋自表达的影响，结果表明，这四个方剂既有共同的反应蛋白，也有各自特异的反应蛋白。共同反应蛋白可能是四方剂防治AD过程中存在的共同或关键作用环节或靶点，有望成为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的重要组成部分。5．运用蛋白免疫印迹实验对醛缩酶C、还原型辅酶I．辅酶Q氧化还原酶等五个差异蛋白的表达进行了验证，结果表明，与双向电泳结合质谱的结果基本一致，提示采用双向电泳结合质谱分离鉴定差异蛋白的结果基本可靠。6．应用免疫印迹实验，观察差异蛋白腺苷酸激酶4(AK4)在SAM海马中表达的动态变化情况，结果显示AK4在2．18月龄快速老化小鼠$AMP8中呈高表达，且随增龄其表达水平有逐步升高的趋势，而在正常对照小鼠SAMRl海马中的表达仅出现于18月龄时，且表达非常微弱，其余月龄SAMRl均未见表达。提示AK4可能是一个老化相关的蛋白，值得进一步深入研究。关键词：黄连解毒汤：学习和记忆；快速老化模型小鼠；海马；蛋白质组学：双向电泳；MALDI-TOF．MS；差异蛋白 硕士学位论文英文摘要TheeffectofHuanglian-Jie-Du-Tangdecoctiononexpressionofhippocampalproteinsinsenescence·acceleratedmouseM．SCandidate：WangShanSupervisor：ProfessorZhouWen-XiaProfessorZhangYong-Xiang(InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijin9100850)Withagingpopulationincreasing,Alzheimer’sdisease㈣hasbeenoneofthefourtopdiseasesthatdoharmtopeople’shealthseriously．AndbecausethepathogenesisofADiscomplicatedandreliestotheabnormalityanddysfunctionofmultisystem,therearestillDOidealdrugsforpreventingandcuringADtillnOW．MoreandmoreinvestigationsindicateitisveryhardtogainsatisfiedeffectsonADaimingatsingletargetbecauseADisacomplicateddiseasecausedbymanyfactors．So，findingandestablishingagroupoftargetswillellhanCethelevelofstudyinganddevelopingdrugsonADandprovidenewscreeningsystemforthena．TraditionalChinesepres翻ptionhasnoticeabledominanceinpreventingandtreatingaging．ManytraditionalChineseprescriptionshavebeenusedinclinicalpracticeandgetconspicuoustherapeuticeffectsinpreventingandtreatingADinOUrcountryandJapan．TheactionsoftraditionalChinegeprescriptionsarcthegeneraleffectscaUSCbymanyingredientsthroughmanywaysandlinks．ComparedwithchemicalmedicineswhichactingOnsingletarget,thetraditionalChineseprescriptionshaveconspicuousadvantagesandcharacteristicsonpreventingandtreatingcomplicateddiseases,such勰AD．Infact,manyclinicalandpharmacologicalstudiesshowedthattraditionalChinfseprescriptionssuchasDangguiShaoyaoSen(Dss)，KaixinSan,LiuwoiDihuangdecoction(un，BawciDihuangdecoction(B吼Huanglian-J'ie-Du-Tang(HLJDT),Tianxinrecipe,GoutengSanandSOonareeffectiveinADorlearningandmemorydysfunctionrelatedwithaging．ThedifferentfunctionsofthosetraditionalChineseprcscripfionssuggestodthattheymayhavedifferenttargetsandmechanismsofaction．Therefore,tostudyandexplorethelinksandtargetsofsometraditionalChineseprescriptionswithdefiniteeffectsOnADwillprovidecluesfordiscoveringdrugtargetsforpreventingandtreatingAD，andbaseforstudyingandexplainingpathophysiologicalprocessesandpathogenesy．In0111"laboratory,underthesupportoftheChineseNationalKeyProjectofBasicResearch,senescenceacceleratedmouse-prone／8(SAMP8)weretreatedwithLW,BW,9 硕士学位论文英文摘要DSS，TXFandHLJDTtofindthedrugreactivegenesandproteinsinbrainagoasrelatedwithcognitiveandlearningandmemoryfunctionswithtechniquesofdifferentialhybridization,genechipsandproteomics．Theaimsweretofindthemaintargetsorlinks如atthoseprescriptionsactedonandasc萌lainonegrouporseveralgroupsoftargetsforScreeningandevaluatingdrugsinpreventingandtreatingADthusestablishthebasisfordevelopingn哪typeofdrugsonAD．Thisstudywas龇importantpartoftheresearchabove．ThemaincontentsWCTClistedbelow．Afterveri助ngtheeffectivenessofHLJDT∞improvinglearningandmemorybybehavioralexperiments，apreliminaryproteomicanalysiswasperformedtoinvestigatetheeffectsofHLJDTOllhippocampalproteinexpressionsinsenescence-acceleratedmice(SAM)andfindthereactiveproteinsofHLJDT．TheresultsofthisstudymayprovidecluesformechanismsofactionofHLJDTOilAD．AttheSalTletime，bycomp缸iIlgandanalyzingthereactiveproteinsofHLJDT,LW,BWandDSS，tofindsomecolTmlOnandspecificreactiveproteinsofthemwouldprovidecluesforproposingandverifythetarga：tsforscreeningandevaluatingdrugsinpreventingandtreatingAD．1EffectsofHUDTonleamingandmemorybehaviorsinSAMP8Thesenescence-acceleratedmouse／prone8(SaMe8)isnowtherelativelyidealanimalmodelforADresearch．ItdevelopsaccelerateddeficitsinlearningandmemorywimagingcompanyingwithalotofneuropathologicchangessimilartoADinthecentralnervoussystelll．Itisusedtoelucidatethefundamentalmechanismofsenescanc&andsenescence-relatedlearningandmemorydysfunctionandtoevaluateeffectsofdrugsforsenescence-relateddiseasesandlearningandmemorydeficiency．SAMP8wasusedaslearningandmemorydysfunctionanimalmodalandtheeffectsofHLIDTonthespatiallearningandmemorytaskwereobserved．Theresultsofspacelearningshowedthatcompared诵thSAMRl．thelatencytofindthesubmergedplatformwasextendedsignificantlyandtheplatformsearchingtimesworedecreasedsignificantlyin12-month-oldSAMP8andoraladministrationofHI．JDT(2．59／kg,2months)significantlyshortenedthelatencyandincreasedtheplatformsearchingtimesofSAMP8．Theresultsofstep-downtestshowedthatcomparedwithSAMRI，successfulmiceofSA～m8decreasedinwainingcoRrse．OraladministrationOfHUDTincreasedsuccessfulmiceofSAMP8．ComparedwithSAMRl．totalnumberoferrorsofSAMP8increasedintestingcourse,oraladministrationofHI_2DTfor2monthsdecreasedthetotalnumberofelTorsofSAMP8．Theseresultssug酗tcdthatHLJDTcouldenhancepassiveavoidancefunctionsofSA～IP8．2EffectsofHLJDTonthehippocampalproteinexpressionsofSAMP8lO 硕士学位论文英文摘要2．1SeparationandidentificationofthedifferentiallyexpressedproteinsinhippocampusOfSAMP8andSAMRl2．1．1Theproteinexpressionsinhippocampusof12-month-oldSAMP8andSAMRlTheproteinexpressionsinhippocampusof12-month-oldSAMP8andSAMRlwereobtainedby2-DEtechniqueandImagcmaster2Dplanitum5．0soRwareanalysis．TheresultsshowedthatcomparedwithSAMRI，therew雠8proteinspotsup-regulatedand21protc／nspotsdown-regulatedinthehippocampusof12-month-oldSAMP8．2．1．2IndentificationandbioinformaticsanalysisofthedifferentialexpressedhippocampalproteinsinSAMRlandSAMP8PeptidemassfingerprintingstPMF)of15proteinspotsworoobtainedbyM』址，DI．1DF·MSaftertrypsindigesting,andtheproteinscorrespondingtopeptidefingerprintingsweresearchedinMascotdatabaseand15proteinswhichallofthemhavingdefinitefunctionsWCI'Oidentified．Therewel-e3proteinsworeup-regulatedand12proteinsWCrOdown-regulated．Accordingtotheirfunctions,15proteinscouldbedividedinto8catigorics：(1)Proteinsrelatedwithenergymetabolism,suchasadenylatekinaso4’A：】呼syIltll勰e，矿拄anspor曲吕mitochondrialFOcomplexsubmitdandisocitratedehydrogenase3(NAD+)alpha．(2)Proteinsrelatedwithproteinsynthesisanddegradation,suchasproteasomebeta4subunikubiquitin-conjugatinge11zymoE2Nandpcptidylprolylisomexase九(3)Proteinsrelated喇thsignaltransduction,suchaspostsynapticdensityprotein95(PSD)．(4)Proteinsrelatedwithtran鲥ptionalcontrol，suchasheterogeneousnuclearribommleoproteinKis(}formb4Hnrpkprotein．(5)Proteinsrelatedwithnucleotidemetabofism,suchas5'Y-nuclcotidase,cytosolicandnucleoside-diphosphatekinaso1．(6)Cytoskeletalprotein,suchasStathminlproteinandmbulinandbeta,2isoform．(7)Proteinsrelatedwithcellcycle,suchasMydoidleukemiafactor2homologandCDCREL-l(CDCrel．1，cell-division-control-relatedprotein1)．(8)Theotherprotein,suchasVillin2．Amongtheseproteins,heterogeneousnuclearribonucleoproteinK，adenylatekiaase4andtubulinandbeta,2isoform聃，e犯up-regulatedinhiplx,campusofSAMP8；andisooitratedehydrogenase3(N√址件)alpha,ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialF0complexsubumitdandpostsynapticdensityprotein95(PSD)，Stathminlprotein,proteasomebeta4subunit,peptidylprolylisomcrase凡5'3’-nuclcotidasc，cytosolic。nucleoside-diphosphatekinasel，ubiquitin-conjugatingcllzymoE2N，Myeloidleukemiafactor2homolog,CDCroI-IandVillin2woredown-regulatedinhiptmcampusofSAMP8．2．2EffectsofHLJDTontheproteinexpressionsinhippocampusofSAMP8 硕士学位论文英文摘要2．2．1SeparationandanalysisofthedifferentiaIexpressedproteinsinhippocampusofSAMP8treatedwithHUDTThechangesoftheproteinexpressionsinhippocampusofSAMP8仃eatodwithHLIDTwereanalysisedby2-DEtechniqueandImagemaster2Dplanitum5．0software．码eresultsshowedthatcomparedwitll12-month-oldSAMP8．therewere18proteinspotsup-regulatedand20proteinspotsdown-regulatedinthehippocampusofSAMP8仕eatedwithHUDT．2．2．2Inden“靠ca髓onandbioinformaticsanalysisoftheproteinspotsthatHUDTaffectedPeptidesmassfing叩intings(PMF)of13proteinspotsoutof14proteinspotsWCI"OobtainedbyMALDI·TOF-MSafl盯trypsindigesting,andtheproteinscorrespondingtoPMFwcresearchedinMascotdatabase,andllproteinswereidentified．Amongtheselproteinstherew啪5proteinsup-regulatedand6proteinsdown-regulatedamong1proteinswithdefinitefunctionsandamong2proteinsweredown-regulatedwithunknownfunctiOILSinS^N母8treatedwithHL砭，I．Accordingtomcirfunctions．11proteinswithdefinitefunctionscouldbederidedinto6categories：(1)Proteinsregulated喇thenergymetabolism,suchasisociWatedchydrogenase3(NAI川alpha,ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialF0complexsubumitd'adenylateldnase4，aldoase3，cisoffom,enolase1，alphanon-neuronandphosphoglyceratemutase1．(2)Proteinsregulated诵tlltranscriptionalcontrol，suchashnrph2protein．(3)cytoskeletalprotein,suchasStathminlprotein．(4)Proteinsregulatedwithaminoacidmetabolism,suchasglutaminesynthctase．(5)Proteinsregulatedwithcellcycle，suchasMyeloidleukemiafactor2homoiogandsept／rillprotein．Amongtheseproteins，isocil=ratedehydrogenase3(NmHalpha,ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialFOcomplexsubumitd，adenylatekinase4，StathminlproteinandMyeloidleukemiafactor2homologwercup-regulatedinhippocampnsof12-month-oldSAMP8treatedwilllHu_DT；aldoase3cisofrom,enolasc1alphanon-neuron,hnrIth2protein,septinll，glutaminesyntbetaseandphosphoglyceratemutaselwercdown-regulatedinhippocampusof12-month-oldSAMP8ne删withHLIDT．Therewore2proteinsweredown-regulatedwithunknownfanctiOIlSinSAMP8treated、ⅣithHLJDT．TheseproteinswithunknownfunctionsmaybeimportanttoHLJDTandtheirconcretefunctionsneedtobestudiedfilrthor．3ComparisonofeffectofLiuweiDihuangdecoctionBaweiDihuangdecoction，DangguiShaoyaosanandHLJDTontheproteinexpressioninhippocampusofSAMP812 硕上学位论文英文摘要Wesummarizedtheproteinexpressionsinhippocampusof12-month-oldSAMP8trcat{xiwithLW,8w,DSSandHI_．JDT,thenobtainedthev．,Otll／IlonreactiveproteinsandrespectivespecificreactiveproteinsofthefourpreseriptiOllS，thenobtainedtheconlmonreactiveproteinsandrespectivespecificreactiveproteinsofthefourprcscriptiOILS．TheresultsshowedthatthereWefe14commonreactiveproteinsofthefourprescripti011S，andthesereactiveproteinsmayprovidescluesforstudyingthenCWdrugtargetsthatmaypreventorc触lrcAD．3。1ThecommonreactiveproteinsAccordingtotheirfunctions,14proteinswiththosecolnnlonreactiveproteinscouldbederidedinto7categories：(1)Proteinsrelated奶men盯gymetabolism,suchasphosphoglyeemtemutasc1，enola∞1alphanon-neuron,aldoase3，cisofrom,isocitratedehydmgenase30q)ay,)alpha,aeonitase2，mimchondrialandpyrephosphatase．(2)Proteinsrelatedwitllmitochondrionfunction,suchasNADH-ubiquinoneoxidoreductaseandpymvatedehydrogenaseE1alpha．(3)Proteinsrelated晰thsignaltransduction,suchastyrosine-pmteinkinaseJAK2(Januskinase210AK-2)andvoltage-dependentanionchannel2．(4)Proteinsrelatedwithn既ironapoptosis,such鹪3-mercaptopyruvatesulfurtransferase．(5)Proteinsrelated而血transcriptionalcontrol，suchashnrph2protein．(6)Proteinsrelated谢mcellcycle,suchasseptinl1protein．(7)Proteinsrelated1Ⅳithproteinsynthesisanddegradation,suchasphosphatidylinositoltransferprotein,alpha．3．2TherespectivespecificreactiveproteinsHeatshockprotein,such弱chap啪msubunit2(b删isspecificreactiveproteinsofBW．ThespecificreactiveproteinsofDSScouldbedividedinto4categories：(1)Proteinsrelatedwimmitochondrionfunction,suchasaldehydedehydrogenase2．aldehydereductase,pyruvatedehydrogenase0ipoamide)betaandglutathioneS-transferase．(2)Proteinsrelatedwithenergymetabolism,suchasadenylatekinaseandtriosephosphatcisomerase．(3)Proteinsrelatedwithsignaltransduction,such雒actinbindingprotein1A．(4’Theoth留proteins,such∞Fsca1proteinandUbiquitincarboxy-terminalhydrolaseL1．ThespecificreactiveproteinsofHI．JDTcouldbedividedinto5categories：(1)Proteinsrelated奶tha／Dineacidmetabolism,such鹤glutaminesynthetase．(2)Proteinsrelated诵thmitochondrionfimetion,suchasATPsynthase,H*transporting,mitochondrialFOcomplexsubumitdandadenylatekinase4．(3)Cytoskeletalprotein,such撼Stathminlprotein．(4)Proteinsrelatedwithcellcycle,suchasMyeloidleukemiafactor2homolog．(5)Theotherproteins,suchasunnamedprotein1andunnamedprotein2．ResultsaboveshowedthathippocampalproteinexpressionswerechangedsignificantlyafterSAMP8wcroadministratedofLW,BW,DSSandHI_JDTorally,andtherewere 硕士学位论文英文摘要comlllonandspecificreactiveproteinsofthefourprescriptions．TheCOmlnonreactiveproteinsmaybethepotentialpathologicalproteinofAD,OHtheotherhand,itsuggestedthereweresimilarapproachesortargetsthatthefourprescriptionsactedon．Thespecificreactiveproteinssuggestedt11atthefourprescriptionshavetllcirOWndifferenttargets,characters,andmechanisms．ThefourprescriptiOIlSmayimproveagingofSAMP8byregulatingtheexpressionofproteinsrelatedwithenergymetabolism，ehondriosome,signaltransduction,neurolldysfunctionandSOon．4ValidationofsomedifferentiaJexpressedproteinsbywesternblotInordertotestthereliabilityofdifferentialexpressedproteinsthatidentifiedbyMALDI-TOF-MSand2-DE,westernblotwasusedtoail；alyzeandvalidatesomedifferentialexpressedproteins．Onthebasisofthefunctionsofdifferentialexpressedproteins,aldolasc3，Cisoform，NADH-ubiquinoneoxidoreduetase,glutathioneS-Wansferase，gluansferasesynthetaseandtyrosine-proteinkinaseJAK2(Janu8kinase2XJAK-2)WCI'echosentobevalidated．Theresultsof2-DEandMALDI-TOF-MSshowedthatcompared诵mage-matchedSAMRl，aldolase3，Cisoformwasup-regulated,DSSandHLIDTcouldreversetheexpressionofitinhippocampusofSAMP8andmadeitdown-regulated；NADH-ubiqulnoneoxidoreductnsewasdown-regulated,BW，DSSandHLIDTcouldl'@!、／crsctheexpressionofNADH-ubiquinoneoxidoreductaseandmadeitup-regulated；glutathioneS-transferasewasdown-regulated，BWandDSScouldrtrcersctheexpressionofglutathioneS-transferaseandmadeitup-regulated；gluansferasesynthetasewasup-regulated,andHLIDTcouldreVer∞theexpressionofgIu柚sfe硼鹏synthetaseandmadeitdown-regulated；tyrosine-proteinkinaseJAK2(Januskinase2xJAK-2)wasup-regulated,LWandBWcouldrcva-sctheexpressionoftyrosine-proteinkinaseJAK2(Jannskinase2XJAK-2)andmadeitdown-regulated．TheresultsofwesternblotWOI'esimilarwiththatof2-DEandMALDI-TOF-MS，suggestingthatdifferentialexpressedproteinsthatidentifiedbyMALDI-TOF-MSand2-DEWCI'efaithfulandeffective．Abovea11．onthebasisofhippocampalproteinexpressionalmapsofSAM,Wefoundthatcomparedwithage-relatedSAMRl．therewel'emanydifferentialexpressedproteinsinhippocampnsofSAMP8．Afterdatabaseretrievalanddocomentsinvestigation,theresultsshowedtha￡thosedifferentialproteinswe增closelyrelatedwitllenergymetabolism,transcriptionalcontrol，andsignaltransductionandSOon,suggestingthatthosedifferentialproteinswerecloselyrelatedwilllprogressivecentrallearningandmemorydeficiencyorpathologicalchangesinbrainofSAMP8．Futhermore,WOobservedtheeffectofHLJDTOntheexpressionofhippoeampalproteinsinSAMP8．Amongthedifferentialexpressedproteins,theexpressionsof翻瑚eproteinscouldbereversedorregulatedbyHLJDT,14 硕士学位论文英文摘要suggesteingthatHLJDTcanimprovethedisorderofenergymetabolism,signaltransduction,&l_rliIloacidmetabolismandSOonandrelieftheprocessofsenescence?TheeffectsofLW,BW,DSSandHLJDTontheproteinexpressionsinhippocampusofSAMP8Wel"OcomparedandtheresultsshowedthattherewefenotonlyCOFflEflonreactiveproteinsbutalsorespectivespecificreactiveproteinsofthefourprescriptions．Itsuggestedthatthefourprescriptionsmayhavecomnlonandrespectivespecificpathways．Westernb10twasusedtoVcfi匆80medifferentialexpressedproteinsthatwereidentifiedby2-DEandMALDI-TOF／MS，andtheresultsshowedtheidentificationofdifferentialproteinsby2-DEandmassspectrawasreliableandsensitive．5TheexpressionofAK4inhippocampusofSAMwithagingAd∞_inenucleotidesincells射importantforperformingandmaintainingmultiplecellularfunctiomthatrely∞cellularenergymetabolism．Theadanylatekinas髂(AKOareafamilyofenzynl镐thateatalyseatheinterconversionofthreeadeninenucleotidesinthecell：M92+ATP(orGTP)+AMP．．-一MgZ+ADP(orGDPp-ADP,maintainingthe‘energycharge’inthesubeellularmilieuandguaranteethenormalfunctionincell．Besides，AKmayparticipatethevitalcellmovementandapotosisindirectlybyaffectingthelevelofATP(orGTP)andADPasaneurotransmitterorneuromodulator．Sofar,sixAKisozymes,AKl，AK2，AK3，AK4,AK5，andAK6，wereidentified．AK4a【istspredominantlyinkidney,weaklyinliverandheartandthelessinbrainAK4hasthefunctionsofallAks’andisthesensitivefactorofhypoxiahavingdirectorindirectrelationship硒tlloxidativestressandapoptosis．ButlittleisknownabouttheroleofAK4insenc97．,cnco．TheresultsofAK4expressioninhippocampusofSAMin2-DEshowedthatAK4didnotexpressinhiplxw．arapnsof2，6’12-month-oldSAMRI，butexpressedhighlyinthesameageofSAMP8．ItsuggestedthatAK4mayhavecloserelationshipwithsentry．once．So,westernblotWasusedtovcd匆theexpressionofAK4inhippocampnsof2，6’12and18-month-oldSAM．TheresultsshowedthatAK4didnotexpressinhippocampusof2，6，12-mouth-oldSAMRlandexpl"01啪dweaklyin18-month-oldSAMRl；Onthecontrary,AK4∞叩阳豁edhighlyinhippocampusof2，6'12，18-month-oldSAMP8，andtheexpressionincreasedwithaging,suggestingthatAK4maycorrelatewithagingcloselybuttherelationshipofthemshouldbetestifiedinthefuture．Aboveall，wecandrawconclusionsbelow：1．Comparedwithage-matchedSAMRl．theabilitiesofspatiallearningdecreasedsignificantly,andtheabilitiesofthepassiveavoidancedecreasedinSAMP8．AfteradministratedofHLJDTorally,theabilitiesofspatiallearningandpassiveavoidanceofSAMP8significantlyenhanced．TheseresultsindicatedthatHLJDTcouldimprove15 硕上学位论文英文摘要thelearningandmemoryabilitiesofSAMP8．2．Therewere29differentiallyexpressedproteinspotsinhippocampusbetween12-month-oldSAMP8andSAMRl，and15proteinswereidentifiedwithdefinitefunctionsbyMALDI-TOF·MS．Theirfunctionsrelatedwithenergymetabolism,proteinsynthesisanddegradation,cystoskeletonandsignaltransductionandSOon．ThosedifferentiallyexpressedproteinsmayrelatewithlearningandmemoryfunctiondisturbanceofSAMP8，andwouldprovidecluesforthestudyofdrugtargetsonpreventingandtreatingADorthemechanismofbrainaginginSAMP8．3．Theexpressionsof38proteinspotsinhippocampnsofSAMP8changedaftertr衄ted研mHLIDTfortwomonths．and13proteinsoutof14proteinswereidentifiedbyMALDI-TOF-MS．ThereWere5proteinsup-regulatedsignificantlyand8proteinsdown-regnlatedsignificantlyaftertreated埘tlIHLJDT．TheresultsshowedthatH／．2DTCanregulatetheexpressionsofhippocampalproteinsofSAMPS,andtheseproteinsprovidedcluesforstudyingthemechanismsofactionofHLJDTanddiscoveringnewdrugtargetsforn'eatingAD．4．TheeffectsofLW,BW。DSSandHLIDTonhippocampalproteinexpressionswe∞compared．Theresultsshowedthattherewerecommonreactiveproteinsandrespectivespecificreactiveproteinsamongthefourprescriptions．TheseeA)mmonreactiveproteinsmaybetheo∞131nonoFkeywaysoFtargetsofthefourprescriptionsandtheycouldbeimportantpartsoftargetsforscreeningandevaluatingthedrugsonAD．5．Aldolase3，Cisoform,NADH-ubiquinoneoxidorcductase,glutathioneS—transferase,O瑚asferasesynthetaseandtyrosine'protcinkinaseJAK2(Januskinase∞0Ag-2)werevalidatedbywesternblotandtheresultsofwesternblotwe拂similarwiththoseof2-DE．Itsuggestedthatdifferentialexpressedproteinsidentifiedby2-DEand～必山DI_TOF强dSwcref越tllfulandeffective．6．ThedynamicexpressionsofAK4inhi--pusofSAM谢magingWereobservedbywcgtelllblor,andtheresultsshowedthatAK4expressedhighlyinhippocampnsof2-18montholdSAMP8andtheexpressionincreasedgraduallywithaging．Onthecontrary，AK4onlyexpressedweaklyin18-month-oldSAMRI．ItsuggestedthatAK4maybeaproteinrelatingwithagingcloselyandworthstudyingfurther．【KeyWordslHuang-Lian-Jie-Du-Tang；senescence-acceleratedmouse；learningandmemory；,hippocampus；proteomics；2-DE；MALDI-TOF-MS；differentiallyexpressedproteins16 硕士学位论文_】‘—o一刖声随着人类生活水平的不断提高和生活环境的同益改善，人类的平均寿命明显延长，老龄化现象日趋显著，以Alzheimer病(Alzheimer’Sdisease,AD，老年性痴呆)为代表的神经退行性疾病的发病率逐渐增高。据统计，目前AD在发达国家已是导致老年人死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症、中风。由于AD发病机理十分复杂，迄今为止尚不清楚，亦无理想的防治药物闯世，因此，给其防治带来了很大的困难，近期很难取得突破性进展【11。西方有专家预言，AD将超越心脏病、癌症、中风而成为2l世纪入类所面临的第一杀手疾病。AD是一种以进行性认知功能障碍和记忆力减退为主要表现的神经退行性疾病，德国医生AloisAlzheimer于1907年首先报告。其主要的病理特征是大脑萎缩，脑内出现大量老年斑(senileplaque,sP)、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)、淀粉样蛋白沉积以及神经元空泡变性和大量丧失，主要发生在颞叶、前额叶皮层、海马等与认知功能密切相关的脑区。AD临床主要表现为进行性学习记忆和认知功能衰退乃至丧失，严重危害着中老年人的健康，也给社会造成了极大的负担。目前关于AD的发病原因尚不明确。虽有多种假说，包括基因突变、神经递质缺陷、炎症、自由基损伤、淀粉样蛋白沉积、激素缺乏、细胞凋亡、钙超载等，但各种假说既有其合理的一面，又均有其局限性，尚不能全面解释AD脑内所发生的复杂而广泛的病理交化。目前世晁各国在寻找AD有效治疗药物的研究中投入了大量的人力和物力，但由于AD病理变化的复杂性，成果却十分有限。目前临床用于治疗AD的化学药物只是干预AD的某一特定病理环节，主要有胆碱酯酶抑制剂、神经营养剂、受体激动剂等，疗效均不理想，虽可暂时改善症状，但远期疗效不好，而且多有较为严重的毒副作用[21。如美国FDAP,批准临床用于治疗AD的Tacrine(THA,他克林)和Aricept(donepezfl,E2020，安理申)，仅能使AD患者的部分认知障碍症状有所改善，疗效十分有限，而且对AD脑内的病理改变——淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结均无任何作用。相比之下，中医药在衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，而且中药复方具有多途径、多靶点的作用特点，在治疗AD方面具有潜在的优势和广阔的开发前景13】。在长期的临床实践中，中医对痴呆的病因病理及证候特点形成了较全面和深入的认识，同时在治疗及预防等方面也形成了较为系统的理论，总结了补肾填精、17 硕L学位论文益气养血、涤痰、活血、凉血、开窍等治疗法则，以及许多行之有效的防治方法和措施。有资料显示，我国和日本等国家在防治AD中广泛使用的中药复方如当归芍药散、开心散、六味地黄汤、八味地黄汤、黄连解毒汤、调心方、钩藤散等。这些中药复方不但在治疗AD方面取得了良好的临床疗效，实验药理学研究结果也表明它们对于AD或学习记忆功能障碍模型动物的学习记忆功能具有显著改善作用，提示它们发挥抗AD作用是具有一定药理学基础的。因此，从这些中药中选择几种疗效明确的代表方剂傲为工具，研究和探索它们发挥益智作用的环节或靶点有望为防治AD药物筛选与研究“组合靶标”的发现提供依据，同时还可能为从药理学角度研究和阐述AD病理生理学过程和发病机制提供新的线索。基于上述原因，本实验室在国家重点基础研究发展规划项目的资助下，选择包括六味地黄汤、八昧地黄汤、当归芍药散、调心方及黄连解毒汤在内的几种功能主治不同的中药复方作为工具药物，以与AD具有相似病理特点的快速老化模型小鼠(senc爆ccncc-acceleratedmouse,SAM)P8亚系(SAMP8)为模型，通过实验治疗并结合抑制消减杂交、基因芯片和蛋白质组学等技术从与学习记忆或认知功能密切相关的脑区寻找药物反应基因和蛋白，旨在通过分析与比较，确定上述中药复方发挥抗AD作用的主要环节或靶点，并据此提出并通过验证确定一组或几组AD防治药物筛选和评价的“组合靶标”，为新型抗AD药物筛选和评价体系的建立奠定基础．本研究就是上述研究的组成部分之一．本研究所选择的黄连解毒汤是清热解毒经典方剂，源于唐代王焘《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味生药组成。临床研究表明该方剂治疗脑血管痴呆及AD都取得了较好疗效【4‘5)，实验药理学研究表盟该方剂可以提高缺血性痴呆模型小鼠【叼及B淀粉样蛋白注射形成AD模型大鼠[71的学习记忆能力，其治疗效应可能与增加大脑皮质和海马脑血流量及抗炎、降低细胞因子和抑制免疫反应有一定关系。但目前尚无全面、深入的研究黄连解毒汤治疗AD作用机理的报道。蛋白质组学是全景式研究蛋白质网络及其动态变化的一门新兴科学，具有整体性、动态性和系统性的特点。这与中药复方注重整体调节、多靶点、多途径的作用特点具有一致性，为中药复方作用机理的研究提供了良好的平台及切入点。蛋白质组学研究一方面可通过寻找疾病或病理相关性蛋白质，观察药效与其表达的相关性，发现药物反应蛋白，进而寻找或发现可能的药物作用分子靶标；另一方面可通过药物反应18 硕士学位论文蛋白或药物作用靶标所提供的线索来研究药物的作用机理。因此，蛋白质组学对于疾病病理机制的阐明及中药复方作用机理的研究均具有重要意义。快速老化模型小鼠(senescence．acceleratedmouse，SAM)包括快速老化的P系(SAM-prone，SAMP)和R系(SAM-resistant,SAMR)两大系。其中SAMP8亚系的显著特征是中枢学习记忆功能随增龄快速衰退，其脑内具有多种与AD相似的病理变化如APP代谢异常及B-淀粉样蛋白含量的升高等【甜，且其对药物治疗具有良好的反应，因此被认为是研究AD发生机理及其防治药物的较为理想的动物模型。SAMRl亚系有着相对正常的生存期，常被用做正常对照。本研究以SAM为动物模型，首先应用行为学实验初步验证黄连解毒汤对SAMP8学习记忆能力改善的作用，然后应用蛋白质组学技术观察黄连解毒汤对SAMP8海马蛋白表达的影响，并对其中的差异蛋白及药物反应蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析，初步获得海马中的黄连解毒汤反应蛋白，为揭示黄连解毒汤作用环节或作用靶点提供依据。同时整合我室以往的研究结果，对LW、BW、DSS、HLIDT四个方剂对SAM海马蛋白表达的影响进行分析和比较，从中获得几个方剂的共同反应蛋白和特异性反应蛋白，为防治AD药物筛选的组合蛋白靶标的研究提供线索，同时也为从药理学的角度研究中枢认知功能的生物学过程提供实验依据。19 硕士学位论文材料与方法一、实验材料(_)动物第一章材料与方法SAM快速老化亚系SAMP8和抗快速老化亚系SAMRl，由日本京都大学引进，本院动物中心繁殖饲养，自由饮水进食，饲养温度为18～25℃。选择12月龄雌性小鼠进行实验。(二)药物黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏和栀子按3：2：2：3比例混合，其中黄连和黄柏，黄芩和栀子分别水煎，以lg生药／10ml纯水的比例煎煮两次，每次2h，过滤后合并上清液，浓缩至O．5g生药／ml，4℃储存备用。组成黄连解毒汤的中药饮片购自同仁堂医药公司。石杉碱甲由本所九室提供，批号为1001030，纯度为98％。【三)主要仪器(四)主要试剂l双向电泳所用试剂二硫苏糖醇(D1D、尿素(Urea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(glycine)、 硕上学位论文材料与方法琼脂糖(agarose)、甘油(glycer01)、溴酚蓝(bromophenolblue)、CHAPS、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N，N-methylene-bis．acrylamide)、三羟甲基氨基甲烷(Tfis)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、低分子量标准蛋白、IPG缓冲液、IPG覆盖液和IPG干胶条(3．10NL，18cm)均购自AmershamPharmacia公司，考马斯亮蓝R-350购自Amrescn公司，其它试剂均为国产分析纯。双向电泳所有溶液均用Milli．Q水配制。2质谱测定所用试剂基质：a．氰基4羟基肉桂酸(a．CCA)购自Bruker公司；溶剂：三氟乙酸(TFA)购自FIuka公司；乙腈(ACN)购自Fisher公司；测序级胰蛋白酶购自Boehringe公司；Milli—Q水。3蛋白免疫印迹所用试剂山羊抗鼠醛缩酶C(aldolaseC)多克隆抗体、山羊抗鼠还原型辅酶I．辅酶Q氧化还原酶(NADH．ubiquinoneoxidoreductase)多克隆抗体、山羊抗酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)多克隆抗体、山羊抗鼠谷氨酰胺合成酶(Glsyn)多克隆抗体、谷胱苷肽-s．转移酶单克隆抗体以及内参Actin(兔抗鼠Actin多克隆抗体)均购自美国Santacruz公司；辣根酶标记兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG以及单克隆抗体lgG均购自北京中山金桥生物技术有限公司；预染的蛋白marker购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。(五)软件ImageDplatinum5．0图像分析软件购自AmershampharmaciaBiotech公司二、实验方法(—)行为学实验1行为学实验中动物分组情况12月龄SAMRl和SAMP8，雄性，共分六组：SAMRl对照组，SAMP8模型组，石杉碱甲组(s舢v口8+}h】pA5×losg／Kg)，黄连解毒汤2．5gag组(SAMP8+HLJDT2．5g／kg)，黄连解毒汤5眺g组(SAMP8+HI_JDT5g／kg)，黄连解毒汤109／kg组