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1、外源性CO对MPTP所致小鼠多巴胺能神经元损伤保护作用【摘要】目的探讨吸入低浓度外源性一氧化碳(CarbonmonoxideCO)对帕金森模型鼠黑质多巴胺神经元的保护作用。方法24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组8只，模型组8只，一氧化碳吸入组8只。小鼠皮下注射1-甲基-4-苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)复制帕金森病模型，给予吸入外源性低浓度CO干预，利用尼氏染色技术和免疫组化染色技术，观察黑质区神经元形态学和多巴胺神经元数量变化，并进行统计学分析。结果尼氏染色结果显示：一氧化碳吸入组黑质区神经元胞浆中蓝染斑块状物质较对照组明显减少，但明显多于PD模型组，以PD模型组
2、黑质区神经元胞浆中蓝染斑块状物质减少或脱失最为明显；一氧化碳吸入组TH阳性神经元数目较对照组明显减少(P4h脱脂，入蒸馏水洗数分钟；0．05％焦油紫醋酸水溶液染色数分钟(镜下观察)，100%酒精1min,二甲苯透明，封片。1．2．5免疫组化染色步骤行SABC法进行免疫组织化学染色：将中脑切片浸入兔抗TH(1：5000Chemcon),随后依次进入生物素化IgG工作液和SABC三抗工作液(北京中山)，室温下各孵育28h,辣根过氧化物酶标记的DAB将免疫产物显为棕黄色.在孵育过程中用PBS溶液代替一抗做空白对照，免疫组织化学染色后,将切片裱于多聚赖氨酸处理的载玻片上,梯度乙醇脱水,二甲苯
3、透明,中性树胶封片。1．2．6统计学处理用光学显微镜观察并确定TH免疫阳性细胞及免疫阳性产物分布部位。每只(动物随机取三张切片，每张切片随机取三个高倍视野，计数每张切片TH阳性神经元数目，并求平均值，各组以(x±s)表示，用方差分析方法进行统计，P<0．05为显著性差异标准。2结果2．1注射MPTP后动物行为对照组动物在注射生理盐水前后,其行为表现无明显差异,MPTP给药组小鼠都出现不同程度的运动障碍,动作迟缓,震颤,竖毛,甚至尿失禁等。对外界刺激反应低下,随着所给MPTP剂量增加,用药时间延长,动物运动障碍程度增加,症状持续时间延长。吸入含CO(500ppm)的医用空气未见动物死亡
4、。2．2中脑黑质区神经元尼氏染色结果一氧化碳吸入组黑质致密部神经元胞浆中蓝染斑块状物质较对照组明显减少，明显多于PD模型组，以PD模型组黑质区神经元胞浆中蓝染斑块状物质减少或脱失最为明显(如图1)。2．3中脑黑质多巴胺神经元免疫组织化学染色结果8对照组黑质区可见大量TH阳性神经元，深染，阳性产物分布于胞浆。模型组TH阳性神经元较对照组明显减少，染色较浅；一氧化碳吸入组TH阳性神经元较对照组明显减少但显著多于模型组，染色较深。统计学处理：对照组TH阳性神经元(59．5±10．2)明显高于模型组(22．5±8．2)P<0．01)和一氧化碳吸入组(38．9±11．0)(P<0．05)；一氧
5、化碳吸入组显著高于模型组(P<0．05)(如图2)3讨论用MPTP制备的动物模型,无论在神经生化和病理组织学特征,还是在运动行为表现方面都酷似人帕金森病(PD),是目前研究PD的理想模型.研究表明，小胶质细胞激活在MPTP介导黑质纹状体损伤中扮演重要角色,MPTP促使小胶质细激活。激活的小胶质细胞呈瀑布样释放各种炎性细胞因子TNF-a,IL-1a,iNOS等，继而引发强烈的炎症反应[3]。黑质内小胶质细胞是其他脑区的4~5倍，故炎性反应强于其他脑区。与接触MPTP导致的帕金森综合征患者相似，PD患者脑内黑质致密部观察到大量反应性小胶质细胞，提示炎性反应介导多巴胺神经元变性，并可使PD
6、进展、恶化、不断加重神经元变性。据此认为，抑制小胶质细胞激活，减少炎性细胞因子的释放,对防治MPTP介导的黑质纹状体损伤极为重要。不同的研究证实，CO对炎性反应有调控作用。在严重创伤、休克、重症感染、免疫性疾病以及氧化应激性损伤疾病等许多病理状态下，机体内CO的产生增多。NakaoA和Neto8JS分别在小肠、NakaoA在肾移植术前预先给予CO(250PPM)可明显减少移植后IL-6、COX-2、ICAM-1iNOS、(TNF-a)mRNA表达，减轻组织水肿及炎细胞浸润[4，5]。Otterbein等通过在体和离体实验发现低浓度的CO能有效的抑制脂多糖(LPS)介导的前炎性细胞因子
7、如TNF-a，及IL-1b的释放并增加其抗炎因子IL-10的表达[6]。尼氏体是神经细胞存在的重要标志，由核糖体和粗面内质网构成，是神经递质和蛋白合成的场所，病理状态下或神经元变性时尼氏体减少或脱失，是反映神经元功能状态的可靠探针[7]。酪氨酸羟化酶(TH)是催化儿茶酚胺神经递质合成的第一步，是从酪氨酸合成DA的限速酶，仅在胞浆中表达，DA神经元中含量丰富，因黑质区其他神经元缺乏TH，故TH免疫反应阳性神经元即DA神经元[8，9]。本实验采用吸入500p.
