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1、大鼠肝星状细胞分离及培养方法实验探究[摘要]目的:探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法:采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心(20000r/min)和细胞悬液低速离心(40×g)去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果:肝星状细胞的得率为(3.6±0.1)×107/肝,肝星状细胞存活率为(92.8±0.8
2、)%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为(96.2±0.5)%。结论:本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。[关键词]肝星状细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定[中图分类号]R329.2+8[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2010)05(b)-030-03Theexperimentalstudyofrathepaticstellatecellsseparationandcul
3、tivationSHIHuimin1,XUJunquan2,WANGDengni2,WANGMingliang2,SONGBinyu2(1.ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,12China;2.ShanxiMedicalUniversityFenyangCollage,Fenyang032200,China)[Abstract]Objective:Toexploreaneconomicalandeasymethodforisolatingandculturin
4、gtherathepaticstellatecellstostudythepathogenesisofhepaticfibrosis.Methods:Adulthealthyrats’isolatedliverswereperfusedbycyclophoraseliquidinvitro.Afterthedensitygradientcentrifugationofnycodenzeatthespeedof20000r/minandthelow-speedcentrifugation(40×g)of
5、cellsuspension,thehigherpurityhepaticstellatecellswereobtained.Therefusalrateofcellscouldidentifytherateoflivecellsinthetrypanbluetest;desminandGFAPimmunocytochemistry(doubleantibodiesandsinglestaining)wereusedtoidentifythepurityofhepaticstellatecells.R
6、esults:Theyieldofhepaticstellatecellswas(3.6±0.1)×107perliver,thesurvivalrateofhepaticstellatecellswas(92.8±0.8)%,HSCsculturedfor24hourswereidentifiedbydesminandGFAP,singlestainingtherateofpositivecellwas(96.2±0.5)%.Conclusion:Theimprovedmethod12increas
7、esthepurityoftheprimaryrathepaticstellatecellsonthebaseofpromisingtheyieldinordertostudytheprimaryhepaticstellatecellsandliverfibrosis.[Keyword]Hepaticsatellitecells;Cellisolation;Primaryculture;Cellidentification肝星状细胞(hepaticsatellitecells,HSCs)是肝脏内的一种
8、非实质细胞,占整个肝脏的8%～13%[1-2]。研究表明,此细胞活化后在形态上将转化为肌成纤维样细胞,在功能上将分泌大量的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)[3-5],导致肝纤维化。一般认为,原代的HSCs适合研究静止的HSCs的生物学行为,而传代培养适合研究活化的HSCs的生物学行为[6]。在健康动物体内,HSCs绝大部分以未活化的形式存在,那么HSCs的活化过程将成为肝纤维化发病机制研究的中心环节。早在1982年,Knook
