抑制mcf7乳癌细胞vegf表达对树突细胞免疫功能影响论文

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1、抑制MCF7乳癌细胞VEGF表达对树突细胞免疫功能影响论文王海燕谭丽莉江彩玉葛银林【摘要】目的探讨抑制MCF7乳癌细胞血管内皮生长因子（VEGF）的表达对树突细胞（DC）免疫功能的影响。方法针对VEGF基因设计小干扰RNA（siRNA）,以脂质体转染法将siRNA导入乳癌细胞MCF7，RTPCR检测干扰VEGF基因后mRNA的表达，CF7乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF7乳癌细胞培养上清液同时添加粒单细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC，利用MTT法和Hoechst33258检测D

2、C刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12（IL12）及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ（IFNγ）的含量。结果VEGF基因经siRNA处理24h后，MCF7乳癌细胞VEGFmRNA和蛋白的表达明显降低，其诱生的DC与MCF7乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比,siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL12和协同刺激外周血PBMC分泌INFγ的能力明显增强。结论siRNA可靶向抑制乳癌MCF

3、7细胞VEGF的表达，下调VEGF后的MCF7细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低。【关键词】树突细胞；血管内皮生长因子；RNA干扰；MCF7细胞［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheeffectofinhibitionofVEGFonimmunefunctionofdendriticcell(DC)secretedbyMCF7breastcancercells.MethodssiRNAVEGFeLipofectamine2000TMastransfectingagent,thecha

4、ngesofVEGFgeneexpressioneasuredbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR),andCF7cells(controlgroup)andfromsiRNAVEGFtreatedMCF7cells(siRNAVEGFgroup)acrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF),interleukin4(IL4)andtumornecrosisfactorα(TNFα).Theproliferativea

5、bilityofTcellsfromhealthyvolunteersstimulatedbyDCsandthetumoricidalactivityofCTLprimedbyDCseasuredbyMTTassayandHoechst33258.TheconcentrationsofIL12inthesupernatantofculturedDCsandIFNγinthesupernatantofcocultivatedDCsperiphra1bloodmononuclearcells(PBMC)RNAandprotein.The

6、tumoricidalactivityagainstMCF7breastcancercells,andtheconcentrationofIL12secretedbyDCsandIFNγproducedbyPBMCatVEGFsecretedbyMCF7cellstoinhibititsexpression,theinhibitionofthesupernatantfromMCF7cellsonDCsdecreasedmarkedlyafterVEGFgeneRNA水平上关闭VEGF基因的表达，观察VEGF基因沉默前后肿瘤细胞

7、分泌的上清液对DC功能的影响，以进一步探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用，为乳癌的临床治疗寻找新的靶点。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂及引物Lipofectamine2000TM及TRIzolReagent购自Invitrogen公司；AMV逆转录试剂盒、兔抗VEGF多克隆抗体（sc507）、ECL发光试剂分别为美国Promega公司、SantaCruz公司和北京普利莱公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品；人白细胞介素12（IL12）和干扰素γ（IFNγ）的ELISA检测试剂盒均购自深圳晶美生

8、物工程有限公司；粒细胞巨细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4（IL4）及肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Peprotech公司。Hoechst33258由碧云天生物试剂公司提供；所有引物均由上