人β┐防御素┐3基因的克隆和序列测定论文

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1、人β┐防御素┐3基因的克隆和序列测定论文.freelerasechainreactionAbstract:AIMToclonethegeneencodinghumanβ-de-fensin-3.METHODSTotalRNAhu-manforeskintissueandplementaryDNAadebyreversetranscriptionastemplateforpolymerasechainreac-tion.PCRproductofexpectedsizeedtoidentifytheclonecon-taini

2、ngtheDNAfragmentofinterest，folloentthatisidenticaltothehBD-3cDNAsequenceregisteredinGenBank.CONCLUSIONhBD-3geneissuc-cessfullyclonedfromhumanforeskintissue.0引言为适应生存的外部环境.freelicrobialpeptide），如Cecropin样抗菌肽、富含Pro残基的抗菌肽、含Gly残基的抗菌肽、富含Cys残基的抗菌肽以及杀菌通透性增加蛋白［1-3］，其中富含Cys

3、残基的碱性抗菌肽被命名为防御素（de-fensin）［4］.这些短肽分子中含有3～4对二硫键，具有独特的稳态结构和广泛的生物学活性，尤其是对细菌等病原微生物广谱的杀伤作用，而备受人们关注.已知的防御素依其结构特征和来源不同，分为四种类型，即α-防御素、β-防御素、昆虫防御素和植物防御素.研究表明，上皮细胞是防御素的一个主要来源.近年发现的β-防御素-1和2（humanβ-defensin1，2，hBD-1，2）在上皮细胞中有着广泛的分布，是机体重要的内源性生物防御素屏障［5，6］.根据最新研究报道，德国学者Harder等［

4、7］又从人牛皮癣的皮肤组织中纯化到β-防御素家族的新成员hBD-3.该蛋白对革兰氏阳性菌具有高效而广谱的杀伤作用.1材料和方法1.1人皮肤总RNA的提取及cDNA的合成临床获取正常人新鲜包皮组织约150mg，用TRIzol试剂（GibcoBRL）提取总RNA，操作按使用说明进行.取2μg总RNA进行反转录（OmniscriptRTkit，Qi-agen）.反应条件为:60℃2min;30℃30min;80℃2min.1.2PCR反应根据GenBank报道的hBD-3的cDNA序列设计一对引物，以反转录产物为模板，采用Taq

5、plusDNA聚合酶（Sangon）进行PCR反应.引物由赛百盛公司合成，其序列为:5’CGGGATCCTGGGTCTCAGCG;3’GGAATTCCACTCTCG-TCATG.引物5’端加上BamHI酶切位点，并设计CG两个保护碱基，3’端加上EcoRI酶切位点，并设计一个G作为保护碱基.在200μLPCR专用薄壁管（Promega）中依次加入10×PCR缓冲液5μL，dNTPs10pmol，引物各25pmol，cDNA2μL，TaqplusDNApolymerase（Sangon）5u，去离子水补充反应体积至50μL.

6、按以下程序进行PCR反应:94℃5min;94℃20s，51℃20s，72℃20s，35循环;72℃30min.产物在20gL-1琼脂糖凝胶上电泳.1.3PCR产物回收从胶上切下含目的片段的电泳条带，用AdvantagePCR-PureKit（Clontech）回收，操作按使用说明书进行，回收体积为20μL.1.4连接反应取PCR产物3μL，pGEM-T-EASY载体（Promega）1μL，2×Buffer5μL，DNA连接酶1μL，在1.5mL微量离心管中混匀，16℃过夜.1.5重组质粒转化DH┐5α感受态宿主菌采用C

7、aCl2法常规制备DH-5α感受态宿主菌［8］，与连接产物在冰水中共浴30min，42℃水浴中休克90s，加入不含氨苄的LB培养基800μL，置37℃45min，离心弃上清，留约100μL残液，加入IPTG和X-gal各15μL，混匀并使菌体重悬，均匀涂布于含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB平板上，37℃过夜.1.6重组质粒的筛选及鉴定从平板中随机挑选数个白色克隆，接种于3mL含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB液体培养基中，固定在37℃摇床上，200rmin-1震荡培养过夜.取1.5mL菌液离心收集菌体，采用华舜小

8、量质粒抽提试剂盒提取质粒，用EcoRI单酶切及PCR鉴定.酶切条件为:质粒8.5μL，10×Buffer1μL，EcoRI（GibcoBRL）2u，37℃，2h.PCR条件如前，其中质粒经100℃水煮变性5min后作为模板.1.7测序含有目的插段的质粒在PE317-A型DNA自动测序仪上（PerkinE