实验指导 - 生物技术大实验

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1、0.1mol/LCaCl2（灭菌）、无菌水、冰、LB液体培养基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨苄青霉素（Amp）、温控摇床。四、仪器耗材.控温摇床(37℃)、冷冻离心机、水浴锅、...*生物技术大实验13实验内容一、质粒DNA的提取二、质粒DNA的检测三、DNA重组技术－酶切、连接四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化五、重组质粒的筛选13实验一、质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。二、实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在

2、pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、主要试剂1．

3、溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH8.0）[0.5MEDTA：93.05gEDTA.Na2，8gNaOH，充分溶解后调pH值至8.0]（灭菌）。[1MTris-HCl（1000mL）：121.1gTris，49mL浓HCl，充分溶解后调pH值至8.0]（灭菌）2．溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合（新鲜配制）3．溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水2

4、8.5ml4.TE缓冲液10mmol/LTris.HCl1mmol/LEDTA(pH8.0)5.70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）6.RNase将RNA酶溶于10mmol/LTris.HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成1310mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。7.LB+Amp100培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。四、仪器耗材恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、

5、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。五、实验步骤（一）细菌的培养将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37℃培养过夜）(二)质粒提取1.将2mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。2.取培养物倒入1.5mL微量离心管中，4000r/min离心2min。3.倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于100uL溶液Ⅰ中，充分振荡

6、混匀，室温放置5min。5.加200uL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5min。6.加入150uL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5min。7.12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000r/min，离心10min，将上清转移到另一离心管中。9.向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min。12000r/min离心10min。倒去上清液，把离心管

7、倒扣在吸水纸上，吸干液体。10.用500μL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11.加入适量（30μL）的TE其中含有20ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。实验二、质粒DNA的检测一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。13DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的

8、净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyc