生命科学生物技术大实验指导

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1、实验一应用TRIzol提取病毒RNA一、实验目的1.了解Trizol法分离总RNA的原理和方法。2.掌握提取、分离总RNA的方法。二、实验原理TRIzol（Guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction）是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂。异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物。在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相

2、，用异丙醇可沉淀回收RNA。     TRIzol试剂可用于小量样品（50－100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、Dotblot、RNase保护分析等。本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。三、实验仪器和试剂1.仪器高速低温高心机，Eppendorf离心管。2.试剂TR

3、Izol试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）、1% DEPC、异丙醇四、操作步骤所提取物为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞中的病毒。所用一切物品无RNA酶。1.在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ml，再加入TRIzol溶液500ml，充分混匀，室温放置10min。2.加入200ml的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。3.离心4℃、13000r/min、15min，取上层液

4、相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。4.加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。5.离心4℃、13000r/min、15min，小心吸去所有上清。底部有RNA，操作需小心。1ml75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min。小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。6.加入适量DEPC处理水(建议立即做RT-PCR。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。)。五、注意事项1.操作时必须戴手套。2.所用的器皿和

5、试剂均须经DEPC水处理或250－300℃干烤4h。3.Trizolreagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。实验二逆转录反应一、实验目的掌握RNA逆转录扩增cDNA的方法和原理二、实验原理RT-PCR是指将逆转录(ReverseTranscription；RT)反应和PCR(PolymeraseChainReaction)反应组合在一起的方法。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，它是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表

6、达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他RNA分析技术更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。三、实验仪器和试

7、剂1.仪器PCR仪、离心机、灭菌的PCR管、移液器等2.试剂实验一中提取的总RNA；随机引物及Oligo（dT）；逆转录酶；dNTP；RNA酶抑制剂四、实验步骤1.在冰浴离心管里面加入模板RNA4mL，引物2mL，去离子水5mL，混匀，离心3-5秒；2.70℃水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；3.加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1mL，dNTP2mL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；4.37℃水浴5分钟，加入1mLAMV-RT反转录酶，混匀；5.37℃水浴1小时（此步是反转

8、录过程）；6.70℃10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70℃保存。五、注意事项1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2.操作人员在实验过程中手套要勤换。3.加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。实验三聚合酶链式反应一、实验目的1.了解聚合酶链反应（PCR）的