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时间:2018-09-15
《生命科学生物技术大实验指导》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验一应用TRIzol提取病毒RNA一、实验目的1.了解Trizol法分离总RNA的原理和方法。2.掌握提取、分离总RNA的方法。二、实验原理TRIzol(Guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction)是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂。异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂,能裂解组织细胞,释放RNA,抑制RNA酶的活性,同时与RNA形成可溶性复合物。在样品裂解或匀浆过程中,TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相,用异丙醇可沉淀回收RNA。 TRIzol试剂可用于小量样
2、品(50-100mg组织、5×106细胞),也可用于大量样品(≥1g组织或≥107个细胞),对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,可用于Northernblot、RT-PCR、Dotblot、RNase保护分析等。本试剂为红颜色,便于区分水相和有机相,同时最大限度的保持RNA的稳定性。三、实验仪器和试剂1.仪器高速低温高心机,Eppendorf离心管。2.试剂TRIzol试剂、氯仿、75%乙醇(0.1% DEPC配制)、1% DEPC、异丙醇四、操作步骤所提取物为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的细
3、胞中的病毒。所用一切物品无RNA酶。1.在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ml,再加入TRIzol溶液500ml,充分混匀,室温放置10min。2.加入200ml的氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管(溶液充分乳化,成乳白状,无分相现象),室温放置10min(由于氯仿沸点低、易挥发,振荡时离心管可能爆开,小心)。3.离心4℃、13000r/min、15min,取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)。4.加入等体积异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,室温放置10min。5.离心4℃、13000r/min、15min,小心吸去所有上清。底部有RNA,操作需小心。
4、1ml75%乙醇洗一遍,离心4℃、8000r/min、10min。小心吸去所有上清,在超净台中干燥5min。6.加入适量DEPC处理水(建议立即做RT-PCR。若要保存,可在上一步加入乙醇后冻存于-70℃,可保存一年;若加入DEPC水后则只能在-20℃保存1个月左右。)。五、注意事项1.操作时必须戴手套。2.所用的器皿和试剂均须经DEPC水处理或250-300℃干烤4h。3.Trizolreagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质,要注意防护。实验二逆转录反应一、实验目的掌握RNA逆转录扩增cDNA的方法和原理二、实验原理RT-PCR是指将逆转录(ReverseTranscript
5、ion;RT)反应和PCR(PolymeraseChainReaction)反应组合在一起的方法。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcameRT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成,它是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-
6、PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他RNA分析技术更灵敏,更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。三、实验仪器
7、和试剂1.仪器PCR仪、离心机、灭菌的PCR管、移液器等2.试剂实验一中提取的总RNA;随机引物及Oligo(dT);逆转录酶;dNTP;RNA酶抑制剂四、实验步骤1.在冰浴离心管里面加入模板RNA4mL,引物2mL,去离子水5mL,混匀,离心3-5秒;2.70℃水浴5分钟,冰浴30秒(此处是为了使引物和模板正确配对);3.加入5×反应液4uL,RNase抑制剂1mL,dNTP2mL(这些应该先配好,然后分再装到每一管),混匀;4.37℃水浴5分钟,加入1mLAMV-RT反转录酶
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