实验一原核生物基因组dna的制备

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1、实验一、原核生物基因组DNA的制备一、实验目的1、掌握从细菌中提取基因组DNA的基本原理2、熟悉利用试剂盒提取细菌基因组DNA的技术流程3、提取卡介苗BCG基因组DNA二、实验原理①裂解细胞②除去蛋白质③析出DNACTAB(cetyltriethylammoniumbromide，十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/lNaCl)中可溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。核酸提纯(1)用氯仿先对

2、此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。(2)降低溶液中盐的浓度(0.3mol/lNaCl)，CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。三、实验材料卡介苗BCG细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）DP302水浴锅、离心机、移液器试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液

3、系统提取细菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料，可高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建等实验。四、实验步骤（1）取细菌培养液1-5ml，10,000rpm，1min，尽量吸净上清。（2）沉淀中加入180μl溶菌酶溶液（20mg/ml），37℃，60min。（3）加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。（4）加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃，10min，溶液变澄清。瞬时离心以去除管盖内

4、壁的水珠。（5）加入220μl无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（8）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（9）重复步骤⑧。（10

5、）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm，2min，弃废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（11）吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm，2min，将溶液收集到离心管中。（为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm，2min）五、实验结果与分析本次实验提取到细菌基因组DNA,用于下次实验的PCR扩增。六、思考

6、题1.操作第（4）步骤的时候，溶液是否变得清亮？如果没有，试分析原因及可能对实验结果产生的影响。解：第四步时，溶液变得清亮。如果溶液没有变澄清，可能是离心不够。2.试分析漂洗液PW的成分，在第（10）步骤中，如果漂洗液没有充分晾干，会导致什么样的后果？解：漂洗液的主要成分是乙醇，如果没有充分晾干，乙醇会影响到酶的活性，对下一步的PCR、酶切都有影响。生工1002班吕孝敏102201212