实验技术 胶体金

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1、实验一：TEM包埋块的制备一、实验目的学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。二、实验材料小鼠肝脏细胞三、实验试剂2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、Epon812包埋液、蜡油四、实验器材离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机五、溶液配置1、磷酸缓冲液（PhosphateBufferSaline,PBS）0.2molL-1PBS配制A液：Na2HPO4.2H2O35.61g加DDW至1000mlB液：NaH2PO4.H2O27.6g加DDW至1000ml2、不同pH磷酸缓冲液的配制pH6.66

2、.87.07.27.47.6A液(ml)18.824.530.536.040.543.5B液(ml)31.225.519.514.09.56.53、Epon812包埋液的配制9Epon812树脂20mlDDSA4.6mlMNA15.3mlDMP-300.8ml六、实验步骤1、切取1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定10-15分钟。2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次（每次3～5分钟）。3、1％锇酸固定30分钟，然后用缓冲液冲洗三次（每次3～5分钟）。4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－10

3、0％－100％，每级3～5分钟5、浸透与包埋：脱水剂：包埋剂=1：2，过夜6、第二天任意时间进行包7、标签用硫酸纸内8、聚合：45℃12h60℃24h样品标签学号9七、注意事项1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入固定液中。并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组织。组织块的大小一般为1mm3。2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中。3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡。5、在制备支持膜的时候手

4、一定要稳，不能抖动，这样制出的膜才会厚薄均一。在将载玻片浸水的时候要缓慢入水，这样才会使膜利用水的张力慢慢的离开载玻片，漂浮在水面上。9实验二、支持膜和胶体金的制备一、实验原理氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程

5、。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。柠檬酸三钠法0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加热至沸腾，加4ml1%

6、柠檬酸三钠水溶液，出现酒红色。金颗粒大小与柠檬酸三钠的关系柠檬酸三钠（ml)41.51.00.75金颗粒的直径（nm)15305060二、实验步骤1、胶体金pH的调节：用0.1molK2CO3调到pH9.02、取7支2ml离心管分别加入1ml胶体金3、再向每支管中加入1ml不同浓度的牛血清白蛋白4、混合均匀后分别加入0.1ml10%NaCl胶体金与标记蛋白的配比：蛋白含量ug（牛血清白蛋白）5、混合均匀后按照下图观察颜色的变化96、确定出包裹胶体金蛋白的量三、注意事项1、配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。2、氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最

7、好是进口的。3、玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。9实验三、制片及超薄切片演示TEM、SEM观察一、实验目的1、掌握透射电子显微镜的成像基本原理及其应用2、掌握扫描电子显微镜的成像基本原理及其应用二、实验原理1、透射电子显微镜的成像基本原理在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。2、扫描电子显微镜的成像基本原理利用二次电子信号成像来

8、观察样品的表面形态。电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成像。三、主